JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Neuroscience
0 görüntülenme • 3:42 dk. • July 8th, 2025
Papain ve DNaz içeren bir ayrışma tüpünde perfüze edilmiş yetişkin fare hipokampus parçalarını alın.
Tüpü mekanik bir ayrıştırıcı üzerine yerleştirin.
Ayrışıcı, dokuyu mekanik olarak parçalar, nöronlar ve glial hücreler dahil olmak üzere hücreleri gevşetir.
Papain, dokunun hücre dışı matrisini parçalayarak hücreleri serbest bırakır. DNaz, kirletici DNA'yı bozar.
Enzimleri inaktive ederek BSA içeren tampon ekleyin.
Büyük kalıntıları temizlemek için süspansiyonu bir süzgeçten geçirin.
Süzüntüyü santrifüjleyin. Enzim açısından zengin süpernatanı atın.
Hücreleri tamponda yeniden süspanse edin ve yeni bir tüpe aktarın.
Yoğunluk gradyan ortamı ekleyin, karıştırın ve karışımı tamponla kaplayın.
Santrifüjleme sırasında, hücreler ve döküntüler yoğunluklarına göre ayrı katmanlar oluşturur.
En üstteki arabellek katmanını ve ortadaki kalıntı katmanını çıkarın.
Hücreleri içeren alt katmana tampon ekleyin ve karıştırın. Yoğunluk gradyan ortamını içeren süpernatanı santrifüjleyin ve atın.
Daha fazla analiz için hipokampal hücreleri tamponda yeniden askıya alın.
Forseps kullanarak, hipokampi doku parçalarını bir C-tüpüne aktarın ve tüpe 30 mikrolitre enzim karışımı 2 ekleyin. Kapağı çevirdikten ve tık sesi gelene kadar sıktıktan sonra, tüpü bir ayırıcıya yerleştirin ve uygun programı çalıştırın. Program çalışırken, 2 mililitre BSA tamponu ile 50 mililitrelik konik bir tüp üzerine yerleştirilmiş 70 mikronluk bir hücre süzgecini önceden ıslatın.
Ayrışma programı tamamlandıktan sonra, ayrışmış dokuya 4 mililitre BSA tamponu ekleyin ve karışımı 50 mililitrelik konik tüp üzerindeki hücre süzgecinden süzün. Ardından, C tüpüne 10 mililitre DPBS ekleyin. Ardından tüpü kapatın, çözeltiyi hafifçe döndürün ve 50 mililitrelik konik tüp üzerindeki hücre süzgecinden süzün. Filtrelenmiş hücre süspansiyonunu santrifüjleyin. Peleti bozmadan süpernatanı atın ve peleti saklayın.
Döküntülerin giderilmesi için, peleti 1.550 mikrolitre soğuk DPBS ile yeniden süspanse edin ve süspansiyonu etiketli 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Ardından, 450 mikrolitre soğuk kalıntı temizleme solüsyonu ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre süspansiyonunu 1 mililitre soğuk DPBS ile nazikçe kaplayın ve ucu konik borunun duvarına karşı tutun. Toplam kaplama 2 mililitre olana kadar işlemi tekrarlayın.
Ardından, süspansiyonu tam hızlanma ve tam fren ile 10 dakika boyunca 3.000 kez g'de santrifüjleyin. En üstteki katmanı aspire edin. Ardından, beyaz orta tabakayı aspire etmek için pipet ucunu ileri geri süpürün. En alttaki katmanı rahatsız etmeden orta katmanın mümkün olduğunca çoğunu çıkarın. Ardından, 2 mililitre soğuk DPBS ekleyin ve karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, süspansiyonu tam hızlanma ve tam fren ile 10 dakika boyunca 1.000 kez g'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı atın ve peleti 1 mililitre BSA tamponunda yeniden süspanse edin.