Name: Motor Sinir transeksiyonu ve Canlı Zebra balığı Glial Hücre Davranışlarının Time-lapse Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Öğrenin, canlı Danio rerio larvalarında motor sinir transeksiyonu sonrası glial hücre davranışlarını time-lapse konfokal mikroskopi ile nasıl görüntüleyeceğinizi. Bu yöntem sinir rejenerasyonu ve glial hücre biyolojisi araştırmalarında değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar üstün teknik destek için değerli tartışmalar ve Nisabı Technologies, Inc için Kucenas Lab teşekkür etmek istiyorum. Çalışma Bilim ve Teknoloji Mükemmellik için UVa Fonu (FEST) (SK) tarafından desteklenmiştir.

1. Ablasyon ve Canlı Görüntüleme Hazırlık ve Zebra balığı Embriyolar montajı <ol><li> Yumurta suda% 0.8 düşük erime agaroz bir stok hazırlayın. Gerekli ° C kadar 4 de 13X 100 mm tek kültür tüpleri ve mağaza içine kısım. </li><li> Floresan motor nöronlar ve ilgi glial hücre tipleri etiketlemek için istikrarlı bir şekilde entegre transgenlerin içeren çapraz yetişkin zebrafish. Doğru evreleme için ° C inkübatör sonra 3 28.5 yumurta su ve yerde Zebra balığı embriyolarının toplayın. </li><li> Yaklaşık 24 saat sonra döllenme (hpf) de, yumurta su çıkarmak ve yumurta suda 1-fenil 2-tiyoüre (PTU) 0.002% ekleyin. Inkübatör embriyolar dönün. </li><li> 24 ve 96 hpf arasında, embriyo bir floresan diseksiyon kapsamı istenilen transgenlerin varlığı için taranmalıdır. Tatlı PTU yumurta su seçilen embriyolar yerleştirin ve inkübatör dönmek. </li><li> Larva 6 gün sonra döllenme (DPF) (veya istenilen yaş) ulaştığınızda, inkübatör kaldırmak, Montaj için birkaç larva seçin ve daha küçük çanak aktarabilirsiniz. </li><li> Çanak su çıkarmak ve hemen PTU yumurta su yaklaşık 0.02% Tricane ile değiştirin. Larva yaklaşık 5 dakika anestezi oturmak için izin verin. </li><li> 30 sn için musluk suyu ve mikrodalga ile bir beher% 0.8 düşük erime agaroz bir kısım yerleştirin veya agaroz eriyene kadar. Kültür tüp agaroz dokunmatik (sıcak değil) için ılık hissediyor kadar beher soğumasını bekleyin. </li><li> Bir anestezi larva seçin ve tek veya çok iyi 35 mm cam alt çanak aktarın. Larva ile transfer edildi herhangi bir su çıkarın, sonra hemen yemeğin altı cam bölümü doldurmak için yeterince sıcak agaroz ile larva kapağı ama büyük bir kubbe oluşturmaz. </li><li> Agaroz sertleşir gibi, çanak altındaki yan larva konumlandırmak için bir diseksiyon iğne kullanın, sonra sırtında sadece biraz larva yatırın. Bu, yaralanma ve sonraki görüntüleme için bir şart olduğumonte larva çanak altındaki cam dokunmadan. Agaroz katılaşmış ve larva hareketsiz kadar bu pozisyonda larva korumak için diseksiyon iğne kullanın. </li><li> Agaroz tamamen sertleştikten sonra, yavaş yavaş tamamen agaroz ve larva kapsayacak şekilde çanak yeterli miktarda Tricane su (bu anestezi için kullanılan aynı Tricane olabilir) pipetle. </li></ol> 2. Lazer Kalibrasyon ve Test <ol><li> Tüm konfokal mikroskop enstrümantasyon, heyecan verici Zebra balığı transgenlerin için uygun diyot lazerler, ve azot pompalı boya lazer açın. &quot;Boş&quot; ışın ayırıcı yerinde olduğundan emin olun, lazer zayıflatıcı tamamen açık olan ve 435 nm Kumarin boya hücre sırada yer alıyor. Bilgisayarda, görüntüleme yazılımını açın. </li><li> Yerine bir 63x 1.2NA suya daldırma hedefi hareket ve amaç üzerine su hedefleri için daldırma orta küçük bir damla uygulayın. Bir 63x objektif iyi lazer ablasyon doğruluğu ve su sağlayacak immersion 6-7 dpf&#39;e Zebra balığı larvaları ile çalışırken gereklidir daha büyük bir çalışma mesafesi, sağlar. </li><li> Lazer kalibrasyon için kullanılacak bir aynalı tarafı ile bir cam slayt edinin. Mikroskop sahneye, slayt, ayna tarafı aşağı bakacak şekilde yerleştirin. </li><li> Aydınlık aydınlatma altında mercek kullanarak, bulmak ve aynada bir çizik ya da aşındırma odaklanın. Aydınlık ışık cam slayt üzerine aşağı parlayan olacak, ancak sadece ayna çizik ya da uzakta kazınmış olan yerlerde hedefi geçecek, mercek ile siyah bakmak için ayna neden ve gravürler noktalar gibi ya da ışık çizgileri. </li><li> Görüntüleme yazılımı kullanarak bilgisayar ekranında gravür bilgileri ve odaklanır. Lazer kalibrasyon ve güç ayarlarını kontrol penceresini açın. &quot;1&quot; darbe sayısı ve &quot;3&quot;% iletim için zayıflatma plakası olarak ayarlayın. Darbe sayısı lazer ilgi her bölge (RO içinde yangın sayısını temsilI) ve% iletim lazer gücünü temsil eder. Doğru kalibrasyon ayarı 63x 1.2NA suya daldırma hedefi için seçili olduğundan emin olun. </li><li> Ana araç çubuğundan elips aracını seçin ve tek bir dairesel ROI oluşturmak için bilgisayar ekranında resmi tıklatın. Resmin üzerine rastgele aralıklı 4 dairesel ROI kalmayıncaya kadar bu 3 kez yapın. </li><li> Bazı sistemler Okülerin için ışık yolu açıksa lazer ateş izin vermez bir güvenlik özelliği içerebilir. Bu durumda, el ile şu anda Okülerin için ışık yolunu kapatmak. </li><li> Lazer ateş. Bu, her dairesel ROI içinde 4 küçük nokta gravür, 1 yaratacaktır. Lazer ateş yoksa, lazer açık ve doğru bağlandığından ve Okülerin için ışık yolu kapalı olduğundan emin olmak için kontrol edin. Lazer yangınlar ancak gravür görülürse, &quot;boş&quot; ışın ayırıcı yerinde olduğundan emin olmak için kontrol edin. Her şey yerinde ise, gravür ar kadar lazer gücü ve &quot;sıkı bağlamak&quot; artışgörebilir örn. 10&#39;dan büyük ayarı bir lazer güç aşındırma cam için gerekli ise, bu lazer plazma kartuşunun değiştirilmesi gerekiyor gösterebilir. </li><li> Kazınmış noktalar seçilen ROI içinde merkezli görünüyorsa, hiçbir kalibrasyon (2.12 devam) gereklidir. Noktalar merkezli değilseniz, kalibrasyon ayarı güncelleştirilmesi gerekiyor. </li><li> Kalibre etmek için, güncelleştirme kalibrasyon ayarı tıklatın. Lazer ateş ve bir görüntü tek kazınmış noktası içeren görünür. Noktası görünmüyorsa, kalibrasyon iptal lazer gücünü artırmak ve tekrar kalibrasyonu başlatın. </li><li> Nokta ortasına tıklayın. Lazer yine ateş edecek, ve başka bir nokta belirir. Bu noktada tıklatın ve kalibrasyon tamamlandığında ve 9 noktalar bir tablo şekilde görünür kadar bu işlemi tekrarlayın. Kalibrasyon başarılı olduğunu kontrol etmek için adımları 2.6-2.9 tekrarlayın. </li><li> Mikroskop aşamasından cam slayt çıkarın ve objektif temizleyin. Ocu için ışık yolu açınlars ve &quot;% 100 ILL&quot; ışın ayırıcı ile &quot;boş&quot; ışın ayırıcı değiştirin. </li></ol> 3. Lazer Ablasyon ve glial hücre Davranışların Time-lapse Konfokal Görüntüleme kullanarak Sinir transeksiyonu <ol><li> Cam slayt tutun ve 35 mm cam dipli yemekleri tutmak için uygun bir sahne ile değiştirmek için kullanılan sahne çıkarın. 63x 1.2NA suya daldırma hedefi kullanmaya devam edin. </li><li> Hedefi suya daldırma orta küçük bir damla uygulayın ve sahne üzerine monte larva ile çanak yerleştirin. Klipler ile çanak stabilize. </li><li> Mercek ve geniş açılı aydınlatma kullanarak, larva odak ve motor sinirleri bulun. Hemisegments 10-20 sinirler tarama ve kesisi için bir motor sinir seçin. </li><li> Görüntüleme yazılımı kullanarak bilgisayar ekranında sinir bir canlı görünümü getirin. Z-uçakları seçin ve akson ve zarar görmemiş sinir glial hücreler bir görüntü kazanır. </li><li> Yakalamak için görüntüleme yazılımı zaman atlamalı görüntüleme ayarları hazırlayınDeneye bağlı olarak 5-30 dakika aralıklarla tüm hücre türlerinin Z-projeksiyonları. Bu ablasyon yapmadan önce geçen zaman için gerekli tüm ayarlarını oluşturmak için iyi, bu nedenle yaralanma tamamlandıktan sonra geçen zaman başlangıç ​​herhangi bir gecikme yoktur. </li><li> &quot;% 100 ILL&quot; ışın ayırıcı çıkarın ve &quot;boş&quot; ile değiştirin. Okülerin için ışık yolu kapatın. </li><li> Sinirin canlı görünümüne dönmek. Transeksiyon olacak akson görmek için uygun floresan kanal kullanın. </li><li> Elips aracını kullanarak, ablasyon için bölgede ince bir eliptik ROI oluşturmak, daha sonra seçilen bölge içinde küçük ROI oluşturun. </li><li> Lazer ayarları kontrol penceresinde, &quot;2&quot; için darbe sayısını ayarlamak ve zayıflama plaka &quot;18&quot;% iletim. Seçilen ROI içindeki lazer ateş. ROI içinde floresan kalıntıları, lazer gücünü artırmak ise, yaklaşık 10 saniye bekleyin ve tekrar lazer ateş. Eğer flüoresan neden olan bir ayara ulaşana kadar bunu yapınce ROI içinde kaybolur için. </li><li> 10 veya daha fazla saniye bekleyin ve floresan için tekrar ablasyon alanını kontrol edin. Aslında photobleached olduğunda bir yatırım getirisi başlangıçta, ablasyon görünebilir dikkat edin. Floresan dönerse, lazer gücünü artırmak ve tekrar lazer ateş. Çiçek açma ROI içinde kaybolur ve 10 saniye içinde geri dönmez kadar bu işlemi tekrarlayın. Bu daha az lazer gücü ile başlar ve gerekli gücü artırmak için en iyisidir. Gerekli lazer gücü bireysel mikroskopi sistemleri, Kumarin boya yaş, örnek montaj, larva yaşı ve doku kalınlığına göre değişebilir. Ideal bir lazer gücü bir kez kurulduktan sonra, bu güç ayarı aynı deneyi daha sonra sinirler üzerinde yeniden kullanılabilmektedir. </li><li> Ablasyon tamamlandığında, zaman atlamalı görüntüleme başlar. </li><li> Geçen zaman tamamlandığında, verileri derlemek ve Z-projeksiyonları her noktası için renk kompozit oluşturmak için görüntüleme yazılımı kullanın. Davranışını analiz etmek için bir QuickTime film oluşturuneş zamanlı olarak akson ve glial hücreler. </li></ol>

<ol><li>Geuna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+3%3A+Histology+of+the+peripheral+nerve+and+changes+occurring+during+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 27-46 (2009).</li>
<li>Hirata, K., Kawabuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+phagocytosis+by+macrophages+and+nonmacrophages+during+Wallerian+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Myelin phagocytosis by macrophages and nonmacrophages during Wallerian degeneration.</a> Microsc. Res. Tech. 57, 541-547 (2002).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+Embryonic+Development+of+the+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of Embryonic Development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Martin, S. M., O'Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wallerian+degeneration+of+zebrafish+trigeminal+axons+in+the+skin+is+required+for+regeneration+and+developmental+pruning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning.</a> Development. 137, 3985-3994 (2010).</li>
<li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), e1129(2009).</li>
<li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphB+signaling+directs+peripheral+nerve+regeneration+through+Sox2-dependent+Schwann+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting.</a> Cell. 143, 145-155 (2010).</li>
<li>Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+nerve-macrophage+interactions+following+peripheral+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury.</a> J. Neurosci. 32, 3898-3909 (2012).</li>
<li>Stoll, G., Muller, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+injury%2C+axonal+degeneration+and+neural+regeneration%3A+basic+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights.</a> Brain Pathol. 9, 313-325 (1999).</li>
<li>Villegas, R., Martin, S. M., O'Donnell, K., Carrillo, S., Sagasti, A., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+degeneration+and+regeneration+in+developing+zebrafish+peripheral+axons+reveals+a+requirement+for+extrinsic+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types.</a> Neural Development. 7, 19(2012).</li>
<li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+on+the+section+of+the+glossopharyngeal+and+hypoglossal+nerves+of+the+frog%2C+and+observations+of+the+alterations+pro-+duced+thereby+in+the+structure+of+their+primitive+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond%22%5BJournal%5D)">Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations pro- duced thereby in the structure of their primitive fibres.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. , 423-429 (1849).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu deneysel tasarım en kritik adımlar şunlardır: 1) in vivo görüntüleme ve 2 yaralanma ve sonraki için uygun montaj larva) temiz bir sinir kesisi oluşturmak için lazer kalibrasyon ve doğru güç ayarlarını seçerek bu minimal ekstra doku hasarı ile sonuçlanır . In vivo görüntüleme ve sonraki analiz için başarılı axotomy sağlamak için, tek tek cam alt yemekleri ya ya da bölücüler ile bir cam alt tabak birden fazla larva monte. Lazer kalibrasyon sonra, sinir kesisi için en uygun parametrel...

Zebra balığı nedeniyle optik şeffaflık sinir sisteminin geliştirilmesi çalışma ve transgenesis kolaylığı, hangi birleştiğinde, bir canlı embriyo dinamik hücre davranışları muhteşem görüntüleme sağlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Zebrabalıkları ve hemen hemen her memeli sinir sisteminin oluşumu, bu model organizma toplanan hücresel ve moleküler bilgileri için gerekli olan genleri paylaştığından Buna ek olarak, başka bir omurgalı türünün ile doğrudan ilişkilendirilebilir. Nöral gelişim çalışmaları için inanılmaz güçlü olsa da, Zebra balığı ve eşsiz özellikler de yaralanma sonrası sinir sistemi korumak ve yeniden mekanizmaları aydınlatmak için potansiyel var. Zebra balığı larvaları geç larva dönemlerinde onların translusensi korumak ve pigmentasyon etkili melanin üretimini veya pigment hücreleri eksikliği genetik mutantlar farmakolojik inhibitörlerinin kullanımı ya ile bloke edilebilir. Bu nedenle, bu model organizma kullanarak yaralanma ve rejenerasyon çalışmayaşlı hayvanlarda iyon mevcuttur ve doğrudan sinir sistemini yeniden hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için benzersiz bir fırsat sunuyor. Bu yazıda, verimli ve tekrarlanabilir Zebra balığı larvalarının PNS içinde sinirler zarar nasıl açıklar. Bu yaralanma paradigma periferik glia ve bağışıklık hücrelerinin yanıtları yanı sıra rejenerasyon sırasında bu nüfus arasındaki etkileşimleri de dejenerasyon sadece eğitim için oldukça rahat, ancak. PNS bir organizma çevre ile etkileşim ve hayatta kalmak için izin, merkezi sinir sistemi (MSS) ve cilt, organlar ve vücudun kas arasında bilgi aktarmak için gerekli olan motor ve duyu sinirleri karmaşık bir ağdır. Bu sinirler birlikte, Myelinating ve non-myelinating Schwann hücreleri ve perineurial Glia, yanı sıra bağ dokusu, aksonların örten ve sonuçta sinir olgun formu dahil olmak üzere çevresel glia. Bu sinirlerin yaralanması süreci k başlatırWallerian dejenerasyon 10 olarak nown. Aksonal parçalanma, bağışıklık işe alım, enkaz temizleme ve yenilenme Bu mekanizma çok kalıplaşmış ve genetik 1. düzenlenir. Memeli sistemlerde önceki çalışmalarda sinir dejenerasyonu ve rejenerasyon, 1, 2, 6, 8 sırasında Schwann hücrelerinin rolleri tanımlamışlardır. Sabit doku ya da hücre kültürü bu çalışmalarda, Schwann hücreleri sadece enkaz temizleme yardımcı olmak için yaralanma siteye makrofajlar işe değil, aynı zamanda miyelin fagositoz kendilerini destekli. Bu çalışmaların son derece bilgilendirici olmuştur, biz gerçek zamanlı olarak in vivo periferik akson hasarına görsel glial tepkiler daha önce hiç var ve başka çalışmalar bu olaylar sırasında çevre glia farklı sınıflar arasındaki ilişkiyi araştırdık. Son zamanlarda, çeşitli laboratuarları biz burada açıklamak ne benzer Zebra balığı ve lazer aracılı akson hasarı kullanarak Wallerian dejenerasyon araştırdık <sup&gt; 4, 5, 7, 9. Bu çalışmaların bazılarında, yüzeysel duyu sinir özel bir yerleşik, iki foton konfokal mikroskop 4, 5, 9 ile genç larvaları axotomized edildi. Başka bir çalışmada, hangi bizimkine çok benzer, ventral motor sinir içinde derin akson bir ticari lazer ablasyon sistemi 7 ile 5 günlük larvaları transeksiyon edildi. Bu deneysel set-up her ikisinde de, odak Wallerian dejenerasyon ve hem de akson ve bağışıklık hücreleri görüntülenmiştir vardı. Bu çalışmalar genişletmek için, daha olgun, miyelinli sinir ve tahlil dejenerasyon ve rejenerasyon sırasında tüm sinir ile ilişkili çevresel glia tepki ile eski larva motor aksonlar yaralanmasına açıklar. Bunu yapmak için, biz de yaralı akson birlikte bu nüfus arasındaki etkileşimleri araştırmak üzere 6 motor sinirler ve 7 gün sonra döllenme (DPF) larva transect ve bireysel glial nüfus yanıtları görselleştirmek. Çift ve üçlü tra kullanarakbu Schwann hücrelerinin ve perineurial glia yanı sıra, aksonlar için bir gösterge de dahil olmak üzere çevresel etiket glia nsgenic hatları, böylece oluşan bir ticari olarak temin edilebilen lazer ablasyon sistemi kullanmak bir azot pompalanmış dönen bir disk konfokal sisteme bağlı boya lazeri (dalga boyu 435 nm) akson kesilerde oluşturmak için. Bu deneysel kurulum bize birbirine akson yaralanma ve ilişkileri özgü periferik motor akson yolları ve zaman atlamalı görüntü farklı glial nüfus yanıtları zarar, canlı, larva Zebra balığı görüntülemenizi sağlar. Bu protokol daha farklı bilimsel soruları için farklı transgenik çizgiler veya genetik mutantlar ile, farklı yaşlardaki Zebra balığı sinir yaralanmaları oluşturmak için adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Feniltiüre</td><td>Sigma</td><td>P7629-100G</td><td></td></tr><tr><td>Finquel Trikain Metansülfonat MS-222</td><td>Argent Chemical</td><td>C-FINQ-UE-100G</td><td></td></tr><tr><td>Düşük erime noktalı agaroz</td><td>Sigma</td><td>A9414-10G</td><td></td></tr><tr><td>Quad CELLview Hücre Kültürü Kapları, Cam Altlı, Steril, Greiner Bio One</td><td>VWR/Greiner</td><td>89125-444</td><td></td></tr><tr><td>Tek kuyulu cam tabanlı Petri kapları 35 x 10 mm, 12 mm kalınlığında</td><td>Willco Wells</td><td><a href="http://www.willcowells.com/en/products/willco-dish-glass-bottom-dishes/gwst-3512/" target="_blank">GWSt-3512</a></td><td></td></tr><tr><td>Tüm bileşenlerle Andor Technology MicroPoint Lazer Sistemi</td><td>- Quorum Technologies, Inc. aracılığıyla satın alındı.</td><td>2203-SYS</td><td></td></tr><tr><td>MicroPoint Lazer Courmarin boya (435 nm)</td><td>Andor Teknolojisi</td><td>MP-27-435-DYE</td><td></td></tr></tbody></table>

motor sinir transeksiyonu ve canlı zebra balığı glial hücre davranışlarının time-lapse görüntüleme

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Inanılmaz esneklik ve plastisite korurken, tutarlı, kalıplaşmış bir şekilde dış uyaranlara tepki oldukça akışkan organ olmasına rağmen sinir sistemi genellikle vücudun bir kablolu bileşeni olarak tanımlanmaktadır. Merkezi sinir sistemi farklı (MSS), periferik sinir sistemi (PNS) önemli tamir yeteneğine sahiptir, ama biz sadece bu olgu yöneten hücresel ve moleküler mekanizmaları anlamaya başladı. Bir model sistem olarak Zebra balığı kullanarak, in vivo görüntüleme ve genetik manipülasyon ile çift rejeneratif çalışmalara benzersiz bir fırsat var. Periferik sinir glia ve bağ doku tabakaları ile çevrili akson oluşmaktadır. Aksonlar perinöriyum adlı bir cep kılıf ile bir fasikül içine sarılmış da olan Schwann hücreleri, myelinating veya olmayan myelinating tarafından ensheathed edilir. Bir yaralanma sonrasında, yetişkin periferik sinir remo için muazzam bir kapasite varve aksonal enkaz ve yeniden innerve hedefleri zarar. PNS rejenerasyon tüm periferik glia rollerini araştırmak için, burada canlı transgenik zebrafish motor sinirleri axotomize ticari olarak satılan azot pompalı dye lazer kullanan bir akson transection tahlil açıklar. Biz daha fazla yaralı ve kontrol sinirlerin zaman atlamalı görüntüleme için bu deneyleri birkaç yöntemleri açıklar. Bu deneysel paradigma sadece glia sinir rejenerasyonu oyun değil, aynı zamanda sinir sistemi onarım yöneten moleküler mekanizmaların tanıtılması için bir platform olabilir rolünü değerlendirmek değil kullanılabilir.

Burada tarif edilen tahlil, in vivo olarak aksonal yaralanma gliyal hücreleri ve diğer sinir-ilişkili hücre popülasyonlarının tepkisini tayin etmek için kullanılabilir. Film 1 bu yöntem ve glial hücreleri çevreleyen yanıtı kullanılarak oluşturulan bir sinir hasarının bir örneği gösterilmektedir. Bu deney (nkx2.2a: megfp) Tg uygulandı; Tg (olig2: DsRed) Zebra balığı, perineurial glia EGFP ve motor nöronlar ifade sitozolik DsRed hedefleyen bir zar ifade edildiği. Yaralanma 6 dpf&#39;e ca...

Periferal sinir sisteminin (PNS) yaralanmadan sonra önemli tamir yeteneğine sahip olmasına rağmen, küçük bu olgu yöneten hücresel ve moleküler mekanizmaları bilinmektedir. Canlı, transgenik zebrafish ve tekrarlanabilir bir sinir kesisi testi kullanarak, sinir dejenerasyonu ve rejenerasyonu sırasında dinamik glial hücre davranışlarını eğitim görebilirsiniz.

Motor Sinir transeksiyonu ve Canlı Zebra balığı Glial Hücre Davranışlarının Time-lapse Görüntüleme

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Bu prosedürün genel amacı, canlı zebra balığı larvalarında periferal sinir yaralanması sonrası glial hücre davranışının zaman aşımıyla görüntülenmesidir. Bu işlem, öncelikle anestezi altındaki zebra balığı larvalarının cam tabanlı petri kaplarında düşük erime noktalı agar üzerine monte edilmesi ve bir diseksiyon iğnesi ile konumlandırılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, monte edilen larvalar konfokal mikroskoba yerleştirilir.Ablasyon için bir sinir seçilir ve hasarsız sinirin aksonlarının ve glial hücrelerinin bir görüntüsü alınır. Ardından sinir boyunca ROI'ler seçilir ve seçilen alanları ablate ederek bir sinir transeksiyonu oluşturmak için lazer ateşlenir. Son olarak, sinir transeksiyonunu takiben aksonlar ve glial hücreler zaman ayarlı görüntüleme (time-lapse imaging) yöntemiyle görüntülenir.Nihayetinde, zaman ayarlı konfokal mikroskopi aracılığıyla sinir dejenerasyonu ve rejenerasyonu sırasında glia hücrelerinin dinamik davranışlarını gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntem; glia hücreleri sinir yaralanmasına nasıl yanıt verir ve farklı glia alt tipleri dejenerasyon ile rejenerasyon sırasında davranışlarını nasıl koordine eder gibi, rejenerasyon ve glia hücresi biyolojisi alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.İlgili motor nöronları ve glial hücre tiplerini floresan ile işaretleyen transgenlere sahip yetişkin zebra balıkları çiftleştirildikten ve embriyolar döllenmeden sonraki 24. saate veya HPF'ye kadar inkübe edildikten sonra, yumurta suyunu uzaklaştırın ve embriyoları inkübatöre geri yerleştirmeden önce yumurta suyu içindeki 1 pH'lık PTU (fenotiyolüre) ile değiştirin. Bu zaman noktasından yaklaşık 96 HPF'ye kadar, istenen floresan genin varlığını taramak için floresan bir diseksiyon mikroskobu kullanın. Pozitif embriyoları taze PTU'lu yumurta suyuna aktarın ve tekrar inkübatöre yerleştirin.Larvalar döllemeden sonraki altıncı güne (DPF) ulaştığında, montaj için birkaç embriyo seçin ve bunları daha küçük bir kaba aktarın. Kabın içindeki suyu boşaltın ve hemen %0,02'lik tricaine içeren PTU'lu yumurta suyu ile değiştirin; larvaları anestezik içinde yaklaşık beş dakika inkübe edin. Metin protokolüne göre önceden hazırlanmış %0,8'lik düşük erime noktalı agar bloğunu, musluk suyu içeren bir behere yerleştirip mikrodalga fırına koyun.30 saniye boyunca veya agar eriyene kadar, beherin içindeki agar tüpü dokunulduğunda ılık hissedilene kadar soğumasını bekleyin. Ardından, anestezi uygulanmış bir larvayı 35 milimetrelik cam tabanlı bir kaba aktarın. Kaptaki tüm suyu uzaklaştırın.Ardından, larvaları kabın cam tabanlı kısmını dolduracak kadar sıcak agar ile hemen örtün. Agar sertleştikçe, bir disseksiyon iğnesi kullanarak larvaları yan tarafa gelecek şekilde konumlandırın. Sonra, larvaların yaralanma ve görüntüleme için gerekli olan kabın altındaki cama temas ettiğinden emin olarak onları hafifçe sırt üstü eğin.Agar katılaşana ve larva hareketsiz kalana kadar larvanın konumunu korumak için iğneyi kullanın. Ardından, agar ve larvaları tamamen örtecek miktarda trica suyunu yavaşça kaba pipetleyin. Tüm konfokal mikroskop donanımını, zebrafish transgenlerini uyarmak için uygun diyot lazerleri ve azot pompalı boya lazerini açın.Boş demet ayırıcı ve 435 nanometre coer ve boya hücresinin yerinde olduğundan emin olun. Lazer atenüatörünü tamamen açın ve ardından 63 x 1.2 na su daldırma lensi ile bir tarafı aynalı bir cam slayt kullanarak görüntüleme yazılımını açın. Aynadaki bir çiziği veya kazıma izini bulmak ve odaklamak için parlak alan aydınlatmasını kullanın.Görüntüleme yazılımını kullanarak, lazer kalibrasyonunu ve güç ayarlarını kontrol eden pencereden bilgisayar ekranındaki kazımaları görüntüleyin ve odaklayın. Ana araç çubuğundan darbe sayısını bir ve zayıflatmayı %3 geçirgenlik olarak ayarlayın. Elips aracını seçin ve bilgisayar ekranındaki görüntüye tıklayın.Tek bir dairesel ROI oluşturmak için, görüntü üzerinde rastgele dağılmış dört dairesel ROI olana kadar işlemi üç kez daha tekrarlayın. Ardından lazeri ateşleyin. Lazer düzgün çalışıyor ve kalibre edilmişse, bu işlem her bir dairesel ROI içerisinde bir adet olmak üzere dört küçük nokta aşındırması oluşturacaktır. Daha sonra lamı mikroskop tablasından çıkarın ve objektifi temizleyin.Lazer ablasyonu kullanarak bir motor siniri kesmek için boş ışın ayırıcıyı %100ILL ışın ayırıcı ile değiştirin. Objektife küçük bir damla su daldırma medyumu uygulayın ve göz merceği ile geniş alan aydınlatmasını kullanarak, monte edilmiş larva içeren petri kabını stabilize etmek için klipsler yardımıyla uygun sahneye yerleştirin. Larvalara odaklanın ve motor nöronları tespit edin.10 ile 20 arasındaki hemi segmentlerdeki sinirleri tarayın ve kesilecek bir motor sinir seçin. Ardından, sinirin canlı görüntüsünü bilgisayar ekranına getirin. Z düzlemlerini seçin ve yaralanmamış sinirin aksonlarının ve glial hücrelerinin bir görüntüsünü elde edin.Ardından, tüm hücre tiplerinin Z projeksiyonlarını 5 ila 30 dakikalık aralıklarla yakalamak için zaman aşımı görüntüleme ayarlarını hazırlayın. Deneye bağlı olarak, %100ILL ışın bölücüyü çıkarın ve yerine boş parçayı yerleştirin. Sinirin canlı görünümüne geri dönün ve kesilecek aksonları görüntülemek için uygun floresan kanalını kullanın.Elips aracını kullanarak, ablasyon yapılacak bölgede ince eliptik bir ROI oluşturun. Ardından, lazer ayarlarını kontrol eden pencerede, seçilen bölge içinde daha küçük ROI'ler oluşturun. Puls sayısını ikiye ve atenüasyon plakasını %18 transmission değerine ayarlayın.Ardından, seçilen ROI'ler içinde lazeri ateşleyin. 10 saniye veya daha fazla bekleyin ve ablasyon yapılan alanı floresans açısından tekrar kontrol edin. Bir ROI'nin aslında fotobeach (foto-beyleme) olmuş olmasına rağmen başlangıçta ablate edilmiş gibi görünebileceğini ve tam bir kesi elde etmek için ablasyon sürecinde ROI'lerin hafifçe modifiye edilmesi gerekebileceğini unutmayın.Floresans geri dönerse, lazer gücünü artırın ve lazeri ateşleyin. R OIS içinde floresans kaybolana ve 10 saniye içinde geri dönmeyene kadar bu işlemi tekrarlayın. Ablasyon tamamlandığında, zaman ayarlı görüntülemeye başlayın ve zaman ayarlı görüntüleme tamamlandığında işlemi bitirin.Verileri derlemek ve her bir zaman noktası için renkli kompozit Z projeksiyonları oluşturmak için görüntüleme yazılımı kullanın. Aksonların ve glial hücrelerin davranışını eş zamanlı olarak analiz etmek için bir QuickTime videosu hazırlayın. Burada açıklanan analiz, glial hücrelerin ve diğer sinirle ilişkili hücre popülasyonlarının in vivo aksonal yaralanmaya verdiği yanıtı değerlendirmek için kullanılabilir.Burada, bu yöntem kullanılarak oluşturulmuş bir sinir hasarı örneği ve çevredeki glial hücrelerin yanıtı gösterilmektedir. Deney, perineural glia hücrelerinde membrana hedefli EGFP ve motor nöronlardale sitozolik DS red eksprese eden altı DPF'lik transgenik zebra balığında gerçekleştirilmiştir. Hasar, bir gövde motor sinirinin rostral projeksiyonu boyunca yapılmış ve ardından hem EGFP hem de DS red kanallarında zaman serili görüntüleme ile izlenmiştir.Bu sayede, yaralanmanın hemen ardından akson ve glial hücre davranışlarının eş zamanlı olarak görselleştirilmesi sağlanmıştır. Bu görüntüler, zaman ayarlı videodan alınmış statik zaman noktalarıdır. Noktalı elips, birinci dakikada lazer kullanılarak ablate edilen ROI'yi göstermektedir.Transeksiyondan veya MPT'den sonra, ablate edilen alanda floresans görülmemiş ve yaralanma bölgesi proksimalden distal güdüye kadar yaklaşık 3,5 mikrometre olarak ölçülmüştür. Bir transeksiyonun başarısı, distal sinir güdüsünün görüntülenmesiyle ve distal akson fragmantasyonu ile hızlı temizlenme dahil olmak üzere Wallerian dejenerasyonu belirtilerinin aranmasıyla doğrulanabilir. 120 MPT'de distal güdüyü boyunca aksonal floresansın yokluğu, bu aksonların gerçekten Wallerian dejenerasyonuna uğradığını ve transeksiyonun başarılı olduğunu gösterir.Lazer ablasyon deneyleri gerçekleştirilirken lazer gücünün ideal bir ayara getirilmesi kritik öneme sahiptir. İdeal lazer gücü ayarları, siniri yalnızca seçilen ROI içinde temiz bir şekilde ablate eder; çok düşük veya çok yüksek olan lazer gücü ayarları ise suboptimal sonuçlar verir; burada lazer gücünün çok düşük olduğu bir yaralanma görülmektedir. Lazeri ateşledikten sonra ROI içinde floresans kalmış, bu da eksik bir transeksiyona yol açmıştır.Öte yandan, bu şekilde gösterildiği gibi, çok yüksek bir lazer gücü aşırı büyük bir ablasyona neden olmuştur. Bu videoyu izledikten sonra, lazerle kesim deneyleri için zebra balığının nasıl sabitleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Azot pompalı boya lazeri kullanarak bir kesi oluşturun ve çevredeki hücrelerin tepkisini zaman ayarlı konfokal görüntüleme ile değerlendirin.

motor-nerve-transection-time-lapse-imaging-glial-cell-behaviors-live

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Burada, uzun vadeli görüntüleme, iki foton görüntüleme ve doku hasarı teknikleri ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme zebrafish embriyolar montaj için bir yöntem açıklanmaktadır.

İki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme canlı zebrafish embriyolar

Bu protokol zebrafish embriyolar yaşayan tek tek nöronların veya nöral krest hücreleri görüntüleme açıklar. Bu yöntem, floresan konfokal zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak cep davranışlar ve aktin lokalizasyonu incelemek için kullanılır.

Zebra balığı Embriyolar Bireysel Nöronlar ve Sinir Crest Hücreler Aktin Sitoiskelet Hücre Motilite ve Canlı Görüntüleme

Bu video, çok renkli konfokal zaman atlamalı görüntüleme ve hedeflenen hücre ablasyon teknikleri verilmektedir. Time-lapse görüntüleme ilgi birden fazla hücre tiplerinin davranışlarını izlemek için...

Transgenik Zebra balığı Multicolor Time-lapse Görüntüleme: Hedefli Nöronal Hücre Ablasyon aktifleşir görselleştirme Retina Kök Hücreler

Kaynak: Lahne, M., et.al. Multifoton Mikroskobu ile Canlı Hücre Görüntüleme için Yetişkin Transgenik Zebra Balığı Retinal Eksplantlarının Kültürü. J. Vis. Uzm. (2017)Bu video, ışık kaynaklı fotoreseptör hasarını takiben agaroza gömülü zebra balığı retinal eksplantlarında Muller glial nükleer göçünün canlı hücre görüntülemesini göstermektedir. Hasarlı fotoreseptörler tarafından salınan tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α), Muller glial hücrelerini aktive ederek mitoz ve nöronal progenitör oluşumu...

Zebra Balığı Retina Rejenerasyonu Sırasında Müller Glial Nükleer Migrasyonunun Canlı Hücre Görüntülemesi

Spinal Transeksiyon sonra, yetişkin zebrabalıkları altı hafta sonrası yaralanma ile fonksiyonel iyileşme var. Larva şeffaflık ve hızlı iyileşme yararlanmak için, larva omurilik transecting için bir yöntem mevcut. Transeksiyon sonra, 3 gün sonrası yaralanma ile 2 gün sonrası yaralanma başlayan duyusal iyileşme gözlemlemek, ve C-bend hareketi.

Larva Zebra balığı Omurilik Kesisi

Zebra balığı retina rejenerasyon çoğunlukla sabit retina kullanılarak incelenmiştir. Ancak, bu tür interkinetic nükleer göç gibi dinamik süreçler rejeneratif tepki sırasında meydana gelen ve altında yatan mekanizmaları araştırmak için canlı hücre görüntüleme gerektirir. Burada, biz multiphoton mikroskopi kullanılarak Interkinetic Nükleer Göç (INM) gerçek zamanlı olarak izlemek için kültür ve görüntüleme koşulları açıklar.

Multiphoton Mikroskopi Canlı hücre Görüntüleme için Yetişkin Transgenik Zebra balığı Retina Eksplantlarından Kültür

Burada zebra balığı embriyonik beynini larva ve çocuk evrelerine kadar in vivo olarak görüntüleyen bir yöntem sunuyoruz. Elektrofizyolojik yaklaşımlardan uyarlanan bu mikroinvaziv prosedür, olgun nöronun hücresel ve hücre altı ayrıntılarına erişim sağlar ve beyin fonksiyonu ve ilaç müdahalesini karakterize etmek için optogenetik ve nörofarmakolojik çalışmalarla birleştirilebilir.

Kafatası ve Deri Temizleme ile Uyanık Zebra Balığı Larvaları ve Yavrularında Tam Aktif Beyin Dokusunun In vivo Görüntülemesi

Omurgalı beyin dokusunu invaze eden glioblastoma (GBM) hücrelerinde mikrotübül dinamiklerinin canlı görüntülenmesine izin veren bir teknik sunuyoruz. Floresan etiketli GBM hücrelerinin ortotopik enjeksiyonunun, yüksek çözünürlüklü intravital görüntüleme ile şeffaf bir zebra balığı beynine bağlanması, in situ kanser invazyonu sırasında sitoiskelet dinamiklerinin ölçülmesini sağlar.

Zebra Balığı Beynini İstila Eden Glioblastoma Hücrelerinde Mikrotübül Dinamiğinin Canlı Görüntülenmesi

Gelişmekte olan zebra balığı optik tektumunda mikroglia hücrelerinin canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için hızlı taramalı konfokal mikroskopiden yararlanan ve bu hücrelerin dinamiklerinin in vivo analizine olanak tanıyan bir yöntem gösteriyoruz.

Zebra Balığı Embriyosunda Mikroglia Dinamiğinin Canlı Görüntülenmesi ve Karakterizasyonu

Burada, konfokal mikroskopi kullanarak GCaMP kalsiyum göstergelerini eksprese eden transgenik zebra balıklarının beyin bölgelerindeki nöral aktiviteyi incelemek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

In vivo (İn canlı) Kısmen Kısıtlanmış Larva Zebra Balıklarında Duyusal Stimülasyonla İndüklenen Nöral Aktivitenin Konfokal Floresan Görüntülemesi

Zebra balığı larva nöromüsküler kavşağı, sinaptik fizyolojiyi incelemek için çekici bir modeldir. Elektrofizyoloji ve optik görüntüleme dahil olmak üzere birçok deneysel tekniğe uygundur. Burada, dik bir epifloresan mikroskobu altında pHluorin bazlı bir prob kullanarak sinaptik iletimi görüntülemek için bir protokol açıklıyoruz.

Diseke Larva Zebra Balığının Nöromüsküler Kavşağında Sinaptik Vezikül Geri Dönüşümünün Canlı Görüntülenmesi

Öğrenin, canlı Danio rerio larvalarında motor sinir transeksiyonu sonrası glial hücre davranışlarını time-lapse konfokal mikroskopi ile nasıl görüntüleyeceğinizi. Bu yöntem sinir rejenerasyonu ve glial hücre biyolojisi araştırmalarında değerlidir.

Motor Sinir transeksiyonu ve Canlı Zebra balığı Glial Hücre Davranışlarının Time-lapse Görüntüleme

Daha fazla video keşfet