Name: CXCR6.Gfp Muhabir Fare kullanma Sağlıklı ve hastalıklı Karaciğer Bağışıklık Hücreleri Uzun Vadeli intravital multiphoton Mikroskopi Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Öğrenin, fare karaciğerindeki lökosit göçünü ve etkileşimlerini intravital multiphoton mikroskopi ile uzun süreli görüntülemeyi. Bu yöntem, karaciğer inflamasyonunda immün hücre dinamiklerini incelemek için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, teknik destek için Aachen Üniversite Hastanesi'nin Merkezi Hayvan tesisine teşekkür eder. Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) ve Disiplinlerarası Klinik Araştırma Merkezi (IZKF) Aachen tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma, RWTH Aachen Üniversitesi Tıp Fakültesi bünyesindeki Disiplinlerarası Klinik Araştırma Merkezi'nin (IZKF) Aachen'in Çekirdek Tesisi olan "İki Foton Görüntüleme" Çekirdek Tesisi tarafından daha da desteklenmiştir.

NOT: deneyler (NIH yayın, 8. baskı, 2011) &#39;bakım ve kullanım Laboratuvar Hayvanlar olan Kılavuzu&#39;nda&#39; Aşağıdaki hayvan çalışmaları düzenleyen Alman mevzuatına uygun olarak yapıldı ve hayvanların korunması konusunda Direktif 2010/63 / AB Bilimsel amaçlı (Avrupa Birliği Resmi Gazetesi, 2010) için kullanılır. Resmi izin hükümet hayvan bakımı ve kullanımı ofis (LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Almanya) verildi. NOT: Kısa vadeli görüntüleme için atlanabilir adımlar hazırlık süresini azaltmak ve cerrahi protokol basitleştirmek için yıldız (*) ile işaretlenmiştir (örn da çekim, 3-D yığınları ya da kısa süreli time-lapse mikroskopi ek). Gerekli Ancak, hayatta kalma süresi büyük ölçüde azalmış olması durumunda Görüntüleme aynı zamanda geniş bir izleme ve sirkülasyon kontrolü olmadan gerçekleştirilebilir. 1. Mikroskop Kurulum ve Ön-cerrahi Hazırlama (5-10 miln) <ol><li> (Mikroskop, güç Lab, lazer, ısıtma yastığı, klima odasının, web cam, şırınga pompası cihazının, solunum) açın sistemi. </li><li> 1.5% Vol Ç 2 Isoflurane Vapor beslemesini ve set İsofluranın seviyesini bağlayın (v / v), küçük bir hayvan solunum cihazına bağlanmak. <ol><li> Kısa süreli görüntüleme için, sadece ilk ip anestezi indüksiyonu sonrası izofluran kullanarak anestezi korumak (adım 2.2). Daha sonra stabil, karaciğer mikro dolaşımı garanti altına almak için hacimce% 2 (hac / hac), izofluran kullanımı, ve 2 saat aşağıdaki görüntüleme zaman tutmak. </li></ol></li><li> 150-200 ul hacminde 120-140 solunum devir / dak solunum ayarlayın. </li><li> Fare agaroz sahne ayarlayın. 40 ° &#39;lik bir açı ile bir çanak (yaklaşık 10 cm x 15 cm, baz) içine dökülerek,% 3 (w / v) agaroz 100 ml hazırlayın. </li><li> Gerekli aletleri toplama cerrahi çalışma alanını ayarlayın. Mikrobiyal enfeksiyonu önlemek için, Sekusept Forte S bir% 1 çözeltisi (kullanarak aletleri% 9.9 w / v dezenfekte) Glutaraldehit w / v% 9.8, deney (Şekil 1A önce 5 dakika için formaldehit). </li><li> Kalan bileşenler elde edilir: Cilt dezenfektan (örneğin,% 10 povidon iyot solüsyonu), karaciğer aşama (yığınları ve köprü), agaroz çözeltisi (% 3 (w / v) PBS içinde)% 5, şırınga pompası (ağ / hac) glikoz çözeltisi anestetik çözeltisi (Ketamin 0.1 mg / ml, iksilazin 0.5 mg / ml, Fentanil 5 ug / ml), pamuklu, n-Butil-2-Cyanoacrylat ve 1x PBS ile (G-5), enjektör pompası olabilir. Ön ısıtma için kuluçka odasına agaroz sahne çanak koyun. </li></ol> 2. Trakeotomi (10-15 dk) <ol><li> 25-28 g ağırlığında ev yetiştiriciliğinde gelen C57BL / 6 fareler kullanın. House, 12 saat aydınlık / 12 saat karanlık çevrimi olan bir ısı- olarak FELASA kılavuzlarına uygun ve nem kontrollü bir ortamda belirli bir patojen içermeyen koşullar altında fareler. Hayvanların standart fareler diyet (koklayın Standart Kemirgen Diyet) ve su ad libitum ücretsiz erişime izin ver. </li><li> Init tarafından fare anestezisiial intraperitonal anestetik II çözeltisi 250 ul (Ketamin 0.1 mg / ml, iksilazin 1 mg / ml, Buprenorfin 10 ug / ml) (İP) enjeksiyon. <ol><li> * Intravital görüntüleme sırasında bakım için, sürekli kesintisiz ip enjeksiyonu ile anestezi çözeltisi I yönetmek (Ketamin 0.1 mg / ml, iksilazin 0.5 mg / ml, Fentanil 5 ug / ml), 0.2 ml / st bir akış oranında bir şırınga pompası cihazı kullanılarak enhalasyon izofluran 0.5% Vol kombinasyonu (hac / hac). </li><li> , Trakeotomi için cildi dezenfekte, 5 dakika (forseps ile örneğin tutam ayak pedi) sonra refleksleri kontrol fare cerrahi hoşgörülü anestezi durumunda ise hazırlık başlar. </li><li> (Şekil 1B) kurumasını önlemek için göz kornea koruyucu krem (örneğin, Dekspantenol 50 mg / g) uygulayın. </li></ol></li><li> Ekstremitelerde için yapışkan bant kullanılarak ventral tarafı açığa hazırlık masaya fareyi sabitleşmek; yavaşça, bu pozisyonda sabitleşmek örneğin., boyun daraltabilir, bir lastik bant kullanarak t bağladımkesici dişler o. <ol><li> Bir pamuklu çubukla dezenfektan uygulayarak, povidon iyot solüsyonu kullanarak cilt ve kürk dezenfekte edin. </li></ol></li><li> Doğrudan çene altına ilk cilt kesme (0.5-1 cm uzunluğunda) gerçekleştirin (Şekil 1C) <ol><li> Dikkatle, tükürük bezlerinin (Şekil 1D) arasındaki bağ dokusunu incelemek. </li><li> Dikkatlice açın kas tüp çevreleyen trakea (Şekil 1E, F) gözyaşı. </li></ol></li><li> Daha sonra havalandırma tüpü sabitleme (Şekil 1G) için trakea altında cerrahi iplik yerleştirin. <ol><li> T-şekilli kesi performans kıkırdak halkaları arasındaki mikro-makas ile Açık trakea (Şekil 1 H) </li></ol></li><li> Insizyon (~ 0.5 cm) ile trakea içine havalandırma tüpü yerleştirin. Ileri tüp itin küçük anatomik forseps ile kaudal ucunu yakala ve yavaşça trakea içine tüp ilerletmek için (Şekil 1I) </li><li> Cerrahi iplik ile tüp sabitleşmek (örn </eiplik ile m&gt;, 5-0) Adım 2.5 trakea içine tüpün etrafında bir düğüm atarak yerleştirilir; Kazara depositioning (Şekil 1J, K) önlemek için cildin borunun ikinci kranial tespiti yapmak. </li><li> Doku yapıştırıcısı (örneğin, n-bütil-2-Cyanoacrylat) (Şekil 1 L) ile sızdırmaz bir kesim. </li><li> Yapışkan bant kullanılarak başında tüp sabitleşmek. </li></ol> 3. laparotomi (15-20 dk) <ol><li> Hipotermi önlemek için ısıtma pedi üzerinde fare yerleştirin. Karın Tıraş, dikkatle deriden saç kaldırmak. Povidon iyot çözeltisi ile traş cilt ve kürk dezenfekte edin. </li><li> Cerrahi makas (Şekil 2A) kullanarak sternum altında kesilmiş küçük bir cilt gerçekleştirin. Kanamayı önlemek için tüm görünür kan damarları dağlama, yanal her iki tarafa da kaburga altında kesim uzatın. </li><li> Dikkatle periton (Şekil 2B) açılış, sternum altında linea alba küçük bir kesim gerçekleştirmek. Cauteriz kullanarak her iki taraf için kesim uzatıntirme (Şekil 2C, D) kanamayı önlemek için. </li><li> Agaroz sahne çanak (Şekil 2E) içine fare yerleştirin. Fare (genellikle 12-14 kapak slipleri) (Şekil 2F) her iki tarafına da, uygun yükseklikte yığınları yerleştirin. </li><li> Solunum ile mikroskop eşitlemek için sırtın üst solunum altında tetik sensörü yerleştirin. Tetik ünitesi (Şekil 2G) etkinleştirin. </li><li> Kaburga (Şekil 2I) geri çekilmesi için sternum ile cerrahi iplik (5-0) yerleştirin. </li><li> Dikkatle kavisli cerrahi makas kullanarak karaciğer ve diyafram (falsiform ligament) bağlayan bağ yanı sıra karaciğer ve gastrointestinal sistem kesti. Aorta (Şekil 2J) aşağı falsiform ligament kesin. </li></ol> 4. Numune Kur (10-15 dk) <ol><li> Büyük karaciğer lobunda kolay erişim için 45 ° &#39;lik bir açı ile sağ tarafta fare yerleştirin. </li><li> Karın kapsayan, kaburga altında evreleme köprü eklekavite. Keskin kenarları (Şekil 2K) kapsayacak şekilde yapışkan bant kaplama standart bir kapak kayma kullanarak bir köprü imalatı. </li><li> Sahnede büyük karaciğer lobu yerleştirin. Dikkatle çift bilyeli kalem probu veya karaciğer altında yastıklı spatula kayma ve ıslak pamuklu bir bez veya ıslak mendil kullanarak organın üst tutun. Slayt üzerine lob kaldırın ve nazik sürükle uygulayın. Lob bükülmüş ya da katlanabilir. Karaciğer (Şekil 2L) sadece nazik manipülasyon için ekstra bakım sağlayın. </li><li> Örneğin, küçük bir kapak fişleri (20 mm x 20 mm), yanındaki karaciğer lobunun yaklaşık aynı yükseklikte yığınları kapak kayma desteklemek için yanal destek hisselerini, yerleştirin. </li><li> Karaciğer lobda büyük kapak kayma (24 mm x 50 mm) yerleştirin. Bu kapak kayma olun mümkün (Şekil 2M) olarak yatay olarak aydınlatmaktadır. NOT: kapak kayma sıkarak olmadan doku ile temas halinde olmalıdır. Engelli kan akımı (beyaz doku) gözle görülür kontrol edin. Microcirc Eğerulation bozulur, daha kazık destek ekleyin. </li><li> * Uzun süreli anestezi ve G-5 uygulama için yer iki bağımsız periton kateterler (Şekil 2N). Bir sonraki arka bacaklarda düşük karın yanal kateter takın. NOT: periton kateterler self-made esnek silikon tüp (Şekil 3) ile 27 G iğne bağlayarak olabilir. </li><li> * Cilde 5-0 cerrahi iplik bir döngü ile sabitleşmek iğne yanlışlıkla değiştirmesini önlemek için. </li><li> * Ben 1 katatere anestezi çözümü ile şırınga pompası takın, 0.2 ml / saat ayarlanmış akış hızı; 0.1 ml / saat kateter 2, G-5, şırınga pompası, sabit akış hızı ekleyin. </li></ol> 5. Fare İzleme <ol><li> * Yeri EKG ön içine elektrotlar ve arka ekstremite (Şekil 4A). </li><li> * 2 seviye sensörü CO son tüp takın. </li><li> (Şekil 4C ısı yastığı bağlı harici sıcaklık sensörü ekle). </li></ol> 6. gömülmesi ve Doku Sabitleme (5-10 dk) <ol><li> 3,% 1 X PBS içinde (ağırlık / hacim) agaroz 100 ml hazırlayın. Sıcaklık 5 ml&#39;lik bir şırınga ve bir 18 G iğne (Şekil 5A) ile 41 ° C &#39;de iken karaciğer gömer. </li><li> Lamel ve fare (Şekil 5B, C) ​​etrafında kalan agaroz dökün. Agaroz tamamen Jelatinize kadar bekleyin. </li><li> Hazırlanan karaciğer lobu (Şekil 5D, E) taramak için yeterli bir viewfield büyük hazırlanması, Heidemann spatula ile fazla agaroz çıkarın. </li></ol> 7. Görüntüleme <ol><li> Mikroskop iklim odasına fare aktarın. </li><li> 1x PBS 50-100 ml ekleyin (37 ° C ısıtılmış). </li><li> Buharlaşma (Şekil 5F) önlemek için numune çanak örtün. </li><li> * 0.5 hacmin% enhalasyon izofluran azaltın (hac / hac). </li><li> * Izleme yazılımı EKG, kalp hızı ve ekspiratuar CO 2 kaydetmeye başlayın. </li><li> Görüntüleme başlatın: la açmakser panjurlar, ilgi alanlarını belirlemek görünüm Z-yığınları için üst ve alt sınırını tanımlamak, ve zaman atlamalı kayıt başlar. Z-sürüklenme düzeltmek için gerekirse (Z-yığınlarının yeniden ayarlayın, örneğin. Sebebiyle kan basıncı ya da sıcaklık dalgalanması, Şekil (5G) değişikliklere. NOT: Hayvanların dolaşımı veya anestezi görüntüleme dönemi veya eğer tamamlanması kararsız hale geldikten sonra, (anestezi uyanış olmadan), boyunları kırılarak fareler kurban. </li></ol>

<ol><li>Dusseaux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+MAIT+cells+are+xenobiotic-resistant%2C+tissue-targeted%2C+CD161hi+IL-17-secreting+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells.</a> Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).</li>
<li>Reese, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+hypoxia+on+liver+secretion+studied+by+intravital+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy.</a> Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).</li>
<li>Bhathal, P. S., Christie, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+fluorescence+microscopy+study+of+bile+ductule+proliferation+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs.</a> Gut. 10 (11), 955(1969).</li>
<li>Stefenelli, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+vascular+system+and+microcirculation+of+the+rat+liver+in+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Wien+Klin+Wochenschr%22%5BJournal%5D)">Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy.</a> Wien Klin Wochenschr. 82 (33), 575-578 (1970).</li>
<li>Hori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+sure+methodology+for+massive+hepatectomy+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse.</a> Ann Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).</li>
<li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+dual-colored+visualization+of+colorectal+liver+metastasis+in+living+mice+using+two+photon+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy.</a> Microsc Res Tech. 75 (3), 307-315 (2011).</li>
<li>Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reperfusion+injury+is+dramatically+increased+by+gentle+liver+manipulation+during+harvest%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl+Int%22%5BJournal%5D)">Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest.</a> Transpl Int. 13, Suppl 1. S525-S527 (2000).</li>
<li>Schemmer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+Kupffer+cells+cause+a+hypermetabolic+state+after+gentle+in+situ+manipulation+of+liver+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280 (6), G1076-G1082 (2001).</li>
<li>Toiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+DSS-induced+cecal+mucosal+damage+in+GFP-transgenic+mice+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy.</a> J Gastroenterol. 45 (5), 544-553 (2010).</li>
<li>Zimmon, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hepatic+vasculature+and+its+response+to+hepatic+injury%3A+a+working+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Yale+J+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis.</a> Yale J Biol Med. 50 (5), 497-506 (1977).</li>
<li>Wong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimal+role+for+selectins+in+the+recruitment+of+leukocytes+into+the+inflamed+liver+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature.</a> J Clin Invest. 99 (11), 2782-2790 (1997).</li>
<li>Bonder, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+for+neutrophil+recruitment+to+the+liver+in+concanavalin+A-induced+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis.</a> J Immunol. 172 (1), 45-53 (2004).</li>
<li>Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+fluorescence+excitation%3A+new+spectral+windows+for+biological+nonlinear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10763-10768 (1996).</li>
<li>Centonze, V. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+excitation+provides+optical+sections+from+deeper+within+scattering+specimens+than+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging.</a> Biophys J. 75 (4), 2015-2024 (1998).</li>
<li>Amore, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multiphoton+imaging+of+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer+disease+reveals+marked+thioflavine-S-associated+alterations+in+neurite+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 62 (2), 137-145 (2003).</li>
<li>Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+inflammatory+leukocyte+recruitment+in+kidney%2C+lung+and+liver--challenges+to+the+multi-step+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver--challenges to the multi-step paradigm.</a> Immunol Cell Biol. 91 (4), 281-289 (2013).</li>
<li>McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+species+specifically+associated+with+thioflavine+S-positive+amyloid+plaques+by+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy.</a> J Neurosci. 23 (6), 2212-2217 (2003).</li>
<li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+Immune+Surveillance+by+CXCR6%2B+NKT+Cells+Patrolling+Liver+Sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids.</a> PLoS Biology. 3 (4), (2005).</li>
<li>Velázquez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+activation+by+innate+cytokines+or+microbial+antigens+can+cause+arrest+of+natural+killer+T+cell+patrolling+of+liver+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids.</a> J Immunol. 180 (4), 2024-2028 (2008).</li>
<li>Wehr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptor+CXCR6-dependent+hepatic+NK+T+Cell+accumulation+promotes+inflammation+and+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis.</a> J Immunol. 190 (10), 5226-5236 (2013).</li>
<li>Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+cells+contribute+to+postischemic+liver+injury+in+mice+by+interacting+with+sinusoidal+endothelium+and+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets.</a> Hepatology. 43 (2), 306-315 (2006).</li>
<li>Egen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+and+T+cell+dynamics+during+the+development+and+disintegration+of+mycobacterial+granulomas%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas.</a> Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).</li>
<li>Beattie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+donovani-induced+expression+of+signal+regulatory+protein+alpha+on+Kupffer+cells+enhances+hepatic+invariant+NKT-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation.</a> Eur J Immunol. 40 (1), 117-123 (2010).</li>
<li>Beattie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+experimental+Leishmania+donovani-induced+hepatic+granulomas+detects+Kupffer+cell-restricted+antigen+presentation+to+antigen-specific+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells.</a> PLoS Pathog. 6 (3), e1000805(2010).</li>
<li>McDonald, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+danger+signals+guide+neutrophils+to+sites+of+sterile+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation.</a> Science. 330 (6002), 362-366 (2010).</li>
<li>Vanheule, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intravital+microscopic+study+of+the+hepatic+microcirculation+in+cirrhotic+mice+models%3A+relationship+between+fibrosis+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis.</a> Int J Exp Pathol. 89 (6), 419-432 (2008).</li>
<li>Jenne, C. N., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+surveillance+by+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune surveillance by the liver.</a> Nat Immunol. 14 (10), 996-1006 (2013).</li>
<li>Zimmermann, H. W., Tacke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+chemokine+pathways+and+immune+cell+infiltration+as+a+novel+therapeutic+approach+in+liver+inflammation+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Allergy+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis.</a> Inflamm Allergy Drug Targets. 10 (6), 509-536 (2011).</li>
<li>Kim, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+microscopy+imaging+of+intact+spinal+cord+and+cerebral+cortex+reveals+requirement+for+CXCR6+and+neuroinflammation+in+immune+cell+infiltration+of+cortical+injury+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites.</a> J Immunol Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).</li>
<li>Karlmark, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+recruitment+of+the+inflammatory+Gr1%2B+monocyte+subset+upon+liver+injury+promotes+hepatic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis.</a> Hepatology. 50 (1), 261-274 (2009).</li>
<li>Heymann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+macrophage+migration+and+differentiation+critical+for+liver+fibrosis+is+mediated+by+the+chemokine+receptor+C-C+motif+chemokine+receptor+8+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice.</a> Hepatology. 55 (3), 898-909 (2012).</li>
<li>Ramachandran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Ly-6C+expression+identifies+the+recruited+macrophage+phenotype%2C+which+orchestrates+the+regression+of+murine+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), E3186-E3195 (2012).</li>
<li>Moles, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TLR2%2FS100A9%2FCXCL-2+signaling+network+is+necessary+for+neutrophil+recruitment+in+acute+and+chronic+liver+injury+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse.</a> J Hepatol. 60 (4), 782-791 (2014).</li>
<li>Hammerich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptor+CCR6-dependent+accumulation+of+%CE%B3%CE%B4+T+cells+in+injured+liver+restricts+hepatic+inflammation+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis.</a> Hepatology. 59 (2), 630-642 (2014).</li>
<li>Syn, W. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKT-associated+hedgehog+and+osteopontin+drive+fibrogenesis+in+non-alcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease.</a> Gut. 61 (9), 1323-1329 (2012).</li>
<li>McDonald, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+CD44+and+hyaluronan+is+the+dominant+mechanism+for+neutrophil+sequestration+in+inflamed+liver+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids.</a> J Exp Med. 205 (4), 915-927 (2008).</li>
<li>Egen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+reveals+limited+antigen+presentation+and+T+cell+effector+function+in+mycobacterial+granulomas%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas.</a> Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).</li>
<li>Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+microcirculation+in+murine+sepsis%3A+role+of+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Surg+Int%22%5BJournal%5D)">Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes.</a> Pediatr Surg Int. 24 (1), 13-20 (2008).</li>
<li>Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neutrophil+in+vascular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The neutrophil in vascular inflammation.</a> Nat Med. 17 (11), 1381-1390 (2011).</li>
<li>Khandoga, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+and+quantitative+analysis+of+leukocyte+directional+migration+and+polarization+in+inflamed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue.</a> PLoS One. 4 (3), e4693(2009).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması açıklamamaktadır.

Bu çalışmanın amacı, karaciğer intravital TPLSM görüntüleme için yüksek ölçüde standardize edilmiş stabil ve tekrarlanabilir bir yöntem geliştirmektir. Genel Intravital görüntüleme hedeflemesi ve geliştirme, homeostasis ve hastalığın farklı lökosit popülasyonlarının etkileşimi aşağıdaki gerçek hayat koşullarında hücresel davranış içine değerli anlayışlar verdi. Ancak, doğrudan diğer katı organlara kıyasla karaciğer yanı sıra yüksek kırılganlık aktarılır hangi nedeniyle solunum ve bağırsak peristaltik hareketi için karac...

hücre ve bütün organlarda hücresel fonksiyonlar ya da hatta bütün bir organizma görselleştirme gövde 2&#39;nin hemen hemen tüm parçaları dahil olmak üzere, 50 yıldan fazla bir büyük bir ilgi olmuştur. Bu nedenle, bazı erken çalışmalar zaten karaciğer 3,4 intravital görüntüleme istihdam. Ancak, çeşitli sınırlamalar karaciğer dokusunun uzun vadeli istikrarlı yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile ilgili güncel var. Nedeniyle diyafram ve gastrointestinal sistem 5 ile yakın temas içinde karaciğer anatomik pozisyonuna, mikroskobik intravital görüntüleme için en yaygın sorun, bağırsak 6 daha az bir ölçüde, peristaltik hareket solunum nedeniyle ve. Diğer katı organlara kıyasla, karaciğer cerrahisi özellikle zordur. Nedeniyle yoğun mikrovasküler yapı, cerrahi manipülasyon, masif hemorajik lezyonlar ikamet bozulmuş mikrosirkülasyon 7 ve ayrıca aktivasyonunu yol açabilir iBu tür Kupffer hücrelerinde 8 olarak mmune hücreleri. Bu nedenle, doku mekanik tespit 6,9 intravital mikroskopi görüntüleme ile müdahale muhtemeldir yerde yayınlanan. Sağlıklı bir karaciğer toplam kan hacminin% 10-15 karaciğer damar içinde bulunduğu, ve organ dolaşımdaki değişiklikler (örneğin, kan basıncı dalgalanmaları oldukça duyarlı bir organ oluşturma, genel kalp debisi 10 civarında% 25 alır ). Bu nedenle, aşırı doku işleme veya merkezi dolaşımı yoluyla örneğin, kayma gerilmesi, yerinden, yaralanma hepatik kan akımı aksamalar yanı sıra karaciğer bağışıklık yanıtları etkileyen, lökosit göç davranışı yapay değişiklikler, bozulmuş karaciğer oksijenlenme ve bu nedenle daha fazla karaciğer hasarına yol açacaktır organ koruyucu ve hayvanın genel yaşam süresidir. Erken mikroskobik çalışmalar Intravital epifloresans mi dayanmaktadırcroscopy, ancak böyle bir fotoğraf ağartma ve düşük penetrasyon derinliği gibi çeşitli teknik kısıtlamalar uzun vadeli karaciğer görüntüleme 4,11,12 için bu tekniğin kullanımını sınırlamak. Bu yeni yöntem, gerçek yaşam durumları 13-15 altında hemen hemen tüm organlarda görüntüleme çalışmaları gerçekleştirmek için teknik yetenekli olduğu gibi 1990&#39;larda multiphoton mikroskopi gelişmesiyle birlikte, fotoğraf beyazlatma veya penetrasyon derinliği sınırlamalar çoğunlukla, çözüldü. Ancak, karaciğer görüntülemesi açısından ana kalan zorluklar vardı: birkaç saat 16 daha uzun süre hepatik Sinüsoidlerde değiştirilmemiş kan akışını ve özellikle kararlı görüntüleme güvence nefes hareketleri, karaciğer dokusunun otofloresansı. Çeşitli çalışmalar karaciğer 17, örneğin, NKT hücreleri 18-20, T hücreleri 21,22, karaciğer makrofajlar 23,24 veya nötrofiller 25, uzun vadeli multiphoton m fonksiyonu ve çeşitli lökositlerin göçünü ele rağmenicroscopy görüntüleme henüz başarılı nedeniyle daha fazla hasara 26 mevcut hasar ve dolayısıyla daha yüksek duyarlılığa bir görev daha zorlu akut veya kronik karaciğer hastalığı olan hayvanlarda, kurulmuş olmasaydı. Ancak, gerçek zamanlı olarak karaciğerde lökositlerin göç davranışlarını ve hücresel fonksiyonu izleme karaciğer homeostazı ve hastalık 27 kendi özel rolü yeni bakış açıları sağlar. Kemokin reseptörü CXCR6, doğal öldürücü (NK) hücreler, NKT hücreleri ve bazı T hücresi popülasyonları 18,28 dahil olmak üzere birçok lenfosit alt, ifade edilir. Farelerde Önceki çalışmalar CXCR6 ve aynı kökenli bağ CXCL16 homeostazı karaciğer sinüsoidlerinden üzerinde NKT hücrelerinin devriye kontrol olabileceğini göstermiştir. Sonuç olarak, (CXCR6 lokusunda yeşil floresan protein [GFP] bir knock-in taşıyan) CXCR6.gfp farelerin kullanılması, beyin 29 gibi çeşitli organ lenfosit göçünü araştırmak için tarif edilmiştirve ayrıca karaciğer 18,20, enflamasyon üzerine CXCR6.gfp hücrelerin infiltrasyonunu artış göstererek. Bu çalışmada verilen yöntemle stabilize koşullar altında uzun bir süre boyunca, bu işlemleri takip edilmesi mümkün olmuştur. Intravital multiphoton bazlı prosedür hayvan ve organın minimal pertürbasyon ile son derece tekrarlanabilir oldu görüntüleme izin; solunum ve dolaşım yakın kontrolü ardından geniş izleme uzun süreli hayvan yaşam için optimize edilmiş; ve son derece esnek ve kolay gibi böbrek veya dalak gibi diğer parankimal organlarda da benimsemeye.

<table><tbody><tr><td>Anestezikler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfin</td><td>Essex Pharma</td><td>997.00.00</td><td>Analgeticum, 0.1 mg / kg</td></tr><tr><td>Fentanil</td><td>Rotex Medica</td><td>Şarj: 30819</td><td></td></tr><tr><td>Fluovac anestezi sistemi</td><td>Harvard Aparatı</td><td>34-1030</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz %5</td> <td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISOFLO (İzofluran Buharı) buharlaştırıcı</td><td>Eickemeyer</td><td>4802885</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Forene Abbott</td><td>B 506</td><td></td></tr><tr><td>İzotonik (% 0.9) NaCl çözeltisi</td><td>DeltaSelect GmbH</td><td>PZN 00765145</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin %10</td> <td>ceva</td><td>Şarj: 36217/09</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin %2</td> <td>medistar</td><td>Şarj: 04-03-9338/23</td><td></td></tr><tr><td>Sarf malzemeleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ml Şırınga</td><td>BD Plastipak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml Erlenmeyer şişesi</td><td>Schott Duran</td><td>21 226 36</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Beher 2x</td><td>Schott Duran</td><td>50-1150</td><td></td></tr><tr><td>2 ml şırınga</td><td>BD Plastipak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-0 Vicryl sütür</td><td>Ethicon</td><td>V7980</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>piyasada bulunan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen Göz ve Burun merhemi</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td>6029009.00.00</td><td></td></tr><tr><td>Change-A-Tip Deluxe Yüksek Sıcaklık Koter Kiti</td><td>Güzel Bilim Araçları A.Ş.</td><td>18010-00</td><td></td></tr><tr><td>Pamuklu Gazlı Bez</td><td>Fuhrmann GmbH</td><td>32014</td><td></td></tr><tr><td>Kapak Kayması, 24x50 mm</td><td>, ROTH</td><td>1871</td><td></td></tr><tr><td>Durapore ipek bant</td><td>3M</td><td>1538-1</td><td></td></tr><tr><td>Tüy tek kullanımlık neşter</td><td></td><td>Tüy 02.001.30.011</td><td></td></tr><tr><td>İnce Delikli Polietilen Boru 0.58 mm ID</td><td>Smiths medical</td><td>800/100/200</td><td></td></tr><tr><td>Histoakril</td><td>Braun</td><td>1050052</td><td>5x 0.5 ml</td></tr><tr><td>Leukoplast</td><td>BSN Medikal A.Ş.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Slaytları</td><td>ROTH</td><td>1879</td><td></td></tr><tr><td>Poli-Alkol Haut&hellip; farblos Antisepticum</td><td>Antiseptica GmbH</td><td>72PAH200</td><td></td></tr><tr><td>Sterican iğnesi 18 G x 1</td><td>B. Braun</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>Sterican iğnesi 27 3/4 G x 1</td><td>B. Braun</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr>Piyasada <td>bulunan</td><td></td><td></td><td>kağıt mendil</td></tr><tr><td>Cerrahi Aletler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amalgam yakıcı 3PL</td><td>Gatz</td><td>0110?</td><td></td></tr><tr><td>Blair ekartörleri (4 uçlu (kör)) x2</td><td>Storz & Klein</td><td>S-01134</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No.7 forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları A.Ş.</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Graefe forseps kavisli x1</td><td>Güzel Bilim Araçları A.Ş.</td><td>11151-10</td><td></td></tr><tr><td>Graefe forseps düz x2</td><td>Güzel Bilim Araçları A.Ş.</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Heidemann spatula HD2</td><td>Stoma</td><td>2030.00</td><td></td></tr><tr><td>İğne tutucu Mathieu</td><td>Güzel Bilim Araçları A.Ş.</td><td>12010-14</td><td></td></tr><tr><td>Makas</td><td>Güzel Bilim Araçları A.Ş.</td><td>14074-11</td><td></td></tr><tr><td>Semken forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları A.Ş.</td><td>11008-13</td><td></td></tr><tr><td>Küçük cerrahi makas kavisli</td><td>Güzel Bilim Araçları A.Ş.</td><td>14029-10</td><td></td></tr><tr><td>Küçük cerrahi makas düz</td><td>Güzel Bilim Araçları A.Ş.</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Standart desen forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları A.Ş.</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Vannas yaylı makas</td><td>Güzel Bilim Araçları A.Ş.</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Ekipman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EKG Tetik Ünitesi</td><td>Hızlı Biyomedikal</td><td>3000003686</td><td></td></tr><tr><td>MICROCAPSTAR Gelgit Sonu Karbondioksit Analizörü</td><td>AD Cihazları</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minivent Typ 845</td><td>Harvard Aparatı</td><td>73-0043</td><td></td></tr><tr><td>Multifoton mikroskobu Trimscope I</td><td>LaVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfusor Compact</td><td>B. Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 8/30 8 kanallı kaydedici</td><td>AD Instruments</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>Sıcaklık kontrollü ısıtma yastığı</td><td>Sygonix</td><td>26857617</td><td></td></tr><tr><td>Sıcaklık sensörü</td><td>ticari olarak temin edilebilir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskoplar için Sıcaklık Kontrollü Sistem -Küp & Box</td><td>Life Görüntüleme Hizmetleri</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cxcr6.gfp muhabir fare kullanma sağlıklı ve hastalıklı karaciğer bağışıklık hücreleri uzun vadeli intravital multiphoton mikroskopi görüntüleme

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

<html> Yaralanmaya yanıt olarak karaciğer iltihabı, monositler, nötrofiller, T hücresi alt kümelerinin, B hücreleri, doğal katil (NK) ve NKT hücreleri de dahil olmak üzere, lökositlerin farklı alt süzmeyi söz konusu eden bir yüksek dinamik bir süreçtir. Bağışıklık hücre göçü izlemek için karaciğer intravital mikroskopi, numune hazırlama ve fiksasyon, optik çözünürlük ve uzun süreli hayvan yaşam konusunda yüksek gereksinimleri özellikle zordur. Ancak, inflamatuar süreçler yanı sıra hücresel etkileşim çalışmaları dinamikleri daha iyi inflamatuar karaciğer hastalığı başlatılması, ilerlemesini ve gerileme anlamak için kritik bilgiler verebilir. Bu nedenle, son derece hassas ve güvenilir bir yöntem yoğun bakım ile kombinasyon halinde göç ve intravital iki-fotonlu lazer tarama mikroskobu (TPLSM) uzun bir süre (yaklaşık 6 saat) fare karaciğer, farklı bağışıklık hücreleri, hücre-hücre etkileşimini incelemek için kurulmuştur izlenmesi. esi &quot;&gt; Resim yöntem yumuşak bir hazırlama ve organın en az pertürbasyon ile karaciğerin stabil bir sabitleme içeren, uzun süreli intravital görüntüleme izleme sağlayan, en fazla 6 saat arasında bir zaman dilimi boyunca hemen hemen hiçbir ışıkla ağartma ya da fototoksik etkileri ile çok renkli multiphoton mikroskopi kullanılarak ve fare hayati parametreleri ve dolaşım, sıcaklık ve gaz değişimi istikrar geniş izleme nedeniyle istikrarlı görüntüleme koşulları, özel lökosit alt gruplarının. CXCR6.gfp karaciğer iltihabı üzerine lenfosit göçünü araştırmak knock-in farelerde bazal şartlar altında ve karbon tetraklorid, periton içine enjekte (ler) i (CCl4) neden olduğu akut ve kronik karaciğer hasarı sonrası intravital karaciğer görüntüleme tabi tutuldu. Doğal Katil (NK) - - ve aynı zamanda, CD4 T hücreleri gibi T lenfositlerinin alt grupları fakat mukozal Associ CXCR6 esas Doğal Katil T (NKT) lenfositlerin eksprese edilen bir kemokin alıcısı, birated değişmez (MAIT) T hücreleri 1. Bir karaciğer hasarı üzerine kendi değişmiş davranış içine ayrıntılı fikir ve hastalığın ilerlemesinde dolayısıyla potansiyel katılımı izin CXCR6.gfp + bağışıklık hücrelerinin göç desen ve konumlandırma ardından.

Bizim Intravital TPLSM yaklaşımı doğrulamak için, biz intravital TPLSM görüntüleme CXCR6 GFP / + fareler tabi. Fareler, ya temel kontrol olarak tedavi edilmeden bırakıldı ve akut karaciğer hasarı 20 uyarılması için karbon tetraklorür, tek bir intraperitoneal enjeksiyon (CCl4) tabi tutuldu. Nedeniyle yeşil floresan Video dizileri 2-5 saatlik bir süre boyunca alındı ​​ve hücreler, zaman içinde takip edildi. Genel hücresel hareketliliğini göstermek için, prosedü...

Karaciğerdeki immün hücrelerin stabil intravital yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi zordur. Burada, yoğun bakım monitörizasyonu ile birlikte intravital multifoton lazer tarama mikroskobu ile fare karaciğerindeki bağışıklık hücrelerinin göçünü ve hücre-hücre etkileşimlerini uzun süreler boyunca (yaklaşık 6 saat) incelemek için oldukça hassas ve güvenilir bir yöntem sunuyoruz.

CXCR6.Gfp Muhabir Fare kullanma Sağlıklı ve hastalıklı Karaciğer Bağışıklık Hücreleri Uzun Vadeli intravital multiphoton Mikroskopi Görüntüleme

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ilerleyen karaciğer inflamatuar hastalığında lökositlerin migrasyonunu ve etkileşimini takip etmektir. Bu hücrelerin karaciğer dokusuna nasıl çekildiğinin altında yatan olaylar dizisini ve immunopatolojideki potansiyel rollerini daha iyi anlamak hedeflenmektedir. Bu işlem, öncelikle hayvanın uzun süreli sağkalımını sağlamak için kritik bir adım olan ve farenin solunumunun kontrol altına alınmasını sağlayan bir trakeotomi gerçekleştirilerek sağlanır.İkinci adım olarak, çok fotonlu mikroskopla organa erişim sağlamak için karaciğeri cerrahi olarak açığa çıkarmak amacıyla fareye laparotomi uygulanır. Ardından, hareket artefaktlarını en aza indirmek için karaciğer, bir rozet içerisine gömülerek sabitlenir ve konumlandırılır. Birkaç saat boyunca gerçekleştirilebilen görüntüleme işlemi; bireysel lökositlerin göçü, konumlanması ve etkileşimindeki değişiklikleri takip eden yüksek çözünürlüklü, zaman ayarlı dizilerin elde edilmesini sağlar.Karaciğer inflamasyonunun gelişme sürecinde bu yöntem; lökosit göçü, hücre-hücre etkileşimleri veya immunopatoloji mekanizmaları gibi akut ve kronik karaciğer inflamasyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin konvansiyonel mikroskopiye göre temel avantajı, uzak kırmızı lazer ışığının benzersiz fiziği sayesinde, çok odaklı mikroskobinin düşük odak ağartması veya fototoksisite ile numuneye neredeyse hiç müdahale etmeden uzun süreli görüntüleme sağlamasının yanı sıra dokunun 100 µm derinliğine kadar optik kesitler alabilmesidir. Sonuç olarak, bu yöntem karaciğer hastalıklarına dair derinlemesine bilgi sağlayabilir.Diğer sistemlere kolayca uyarlanabilir. Stabilizasyon ve fiksasyon yöntemi sayesinde, doku hemen hemen tüm intravital mikroskopi sorularına uygulanabilir; böylece akışkanla ilişkili hücreler kullanılarak dalak, böbrek veya hatta deri altı tümörleri gibi organlar kolayca görüntüleyebilir. Ayrıca tüm lökosit alt kümelerini görselleştirmek ve bunların etkileşimlerini ve karaciğer inflamasyonunu izlemek de mümkündür.Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler küçük hayvan cerrahisinin aşırı karmaşıklığı nedeniyle zorluk yaşayacaktır. Ancak, kendi deneyimlerimize göre bu durum yalnızca birkaç hafta için kısıtlayıcı bir faktördür ve sadece biraz pratik rutin gerektirir. Karaciğer dokusunun hassasiyeti nedeniyle hazırlık aşamalarının öğrenilmesi zordur ve yöntemin görsel olarak gösterilmesi temel bir gerekliliktir. Anestetikler hazırlandıktan sonra, fare sahnesini 40 derecelik bir açıyla dökerek %3'lük aos ile doldurun.Ardından, cerrahi çalışma alanının yanıca gerekli tüm aletlerin ve diğer ekipmanların tamamen dezenfekte edildiğinden emin olun. Daha sonra, fareyi intraperitonal bir anestezik kokteyl enjeksiyonu ile anestezi altına alın. Beş dakika sonra hayvanın reflekslerini kontrol edin ve ardından cildi dezenfekte edip gözlere oftalmik pomad uygulayın.Şimdi, fareyi hazırlık masasına sabitleyin. Bant kullanarak, boynu hafifçe gererek ventral tarafı açığa çıkaracak şekilde konumlandırın. Kesici dişlere takılan bir paket lastiği ile bu işlem gerçekleştirilebilir.Şimdi, çenenin altına yaklaşık 0,5 ile 1 cm uzunluğunda ilk kesiyi yapın. Ardından, tükürük bezleri arasındaki bağ dokusunu dikkatlice diseke edin ve trakeayı çevreleyen kas tüpünü bulun. Trakeayı açığa çıkarmak için kası nazikçe yırtın.Trakeanın altına bir ip çekin, ardından T şeklinde bir insizyon yaparak trakeayı mikro makasla açın. Ventilasyon tüpünü yaklaşık yarım santimetre kadar yerleştirin. Tüpü küçük anatomik pensler kullanarak ilerletin.Ardından tüpü sütürlerle sabitleyin. Daha fazla güvenlik sağlamak için tüpü cilde sütüre edin, ciltteki insizyonu siyanoakrilat kullanarak kapatın ve tüpü hayvanın başına sabitleyin. Yapışkan bant kullanarak, %2 izofluranın sürekli akışıyla anesteziyi sürdürün.Fare cerrahiye hazırlandıktan sonra, sternumun altına küçük bir cilt insizyonu yapın ve kesiyi her iki yanda kaburgaların altına doğru lateral olarak genişletin. Bu işlem sırasında açığa çıkan tüm kan damarlarını koterize edin. Kanamayı en aza indirmek için, abdominal kaviteye erişim sağlamak amacıyla linea alba bölgesinde küçük bir başlangıç kesisi yapın.Kesiş boyunca yatay olarak genişleterek tüm kan damarlarını mühürleyin ve karaciğere erişim sağlayın. Şimdi, fareyi agro sahnesine aktarın ve hayvanın sabit durmasına yardımcı olmak için her iki yanına lamlar dizin. Bu lam yığınları farenin yüksekliğiyle uyumlu olmalıdır, böylece daha sonra yerleştirilecek olan karaciğer sahnesi abdomen üzerine aşırı basınç uygulamaz.Şimdi, sternumdaki sütürleri kullanarak kaburgaları geri çekin. 4-0 sütür yeterli olacaktır. Kaburgaları geri çektikten sonra, karaciğeri ve diyaframı birbirine bağlayan ligamentleri aortaya kadar kesin ancak damarı yırtmamaya veya kesmemeye ekstra özen gösterin. Ayrıca karaciğeri ve gastrointestinal sistemi birbirine bağlayan ligamenti de kesin.Daha büyük olan karaciğer lobuna erişimi kolaylaştırmak için fareyi 45 derece döndürün. Standart bir lamel alın ve kenarlarının keskin olmaması için kenarlarına bant yapıştırın. Bunu abdominal boşluğun üzerine yerleştirin.Bu, karaciğerin üzerine yerleştirileceği bir platform görevi görecektir. Çift uçlu küresel bir stylus probunu veya yumuşak uçlu bir spatulayı dikkatlice karaciğerin altına kaydırın ve organın üst kısmından tutun. Nemli bir doku kullanıldığında, mekanik basınç karaciğer dokusunda anında lezyona yol açacaktır, bu nedenle organın dikkatle taşınması esastır.Ardından lobu lam üzerine kaldırın ve nazikçe çekerek konumlandırın. Lob genellikle bükülmüş veya katlanmış durumda kalacaktır; ince bir spatula veya nemli bir doku yardımıyla dokuyu kaldırarak kenarları nazikçe açmaya çalışın. Daha sonra, lamel veya lamlar şeklinde yan destekler ekleyin.Lamelleri karaciğer lobu ile aynı yüksekliğe gelecek şekilde üst üste dizin. Karaciğerin konumlandırılması ve fikse edilmesi, protokoldeki en kritik adımdır. Her türlü mekanik stres, torsiyon veya basınç; anında doku hasarına veya en azından sinüzoidal damarlarda kan akışının bozulmasına yol açacaktır.Şimdi, kenarları bantlanmış büyük bir kapatma camını, yan desteklerle sabitlenmiş karaciğer lobunun üzerine yerleştirin. Bu kapatma camını mümkün olduğunca düz bir şekilde konumlandırın. Karaciğeri sıkıştırmamalıdır.Görüntüleme işlemi hızlıca tamamlanmayacaksa, beyaz doku bozulmuş kan akışına işaret eder. Uzun süreli anestezi sağlamak ve G beş uygulamak için iki bağımsız intraperitoneal kateter yerleştirmek gerekir. Bunlar, 27 gauge iğneler ve esnek silikon borulardan monte edilir.Ardından şırınga pompalarını kullanarak akışlarını başlatın. Kateterleri arka ekstremitelerin yakınındaki alt karın bölgesine yerleştirin. Fareye yaşamsal bulgu monitörlerini bağladıktan sonra, bir XPBS içerisinde 100 mililitre %3 aros hazırlayın.Aros 41 °C'ye soğuduğunda, 18 gauge iğneye sahip beş mililitrelik bir şırınga kullanarak karaciğeri içine gömün. Aeros soğuduktan sonra, fazlalıkları temizlemek ve karaciğeri tarayacak kadar geniş bir görüş alanı oluşturmak için bir heideman spatülü kullanın. Ardından tarama işlemine geçin.Görüş alanı hazırlandıktan sonra, zaman ayarlı görüntüleme için uygun tarama alanlarını seçmek amacıyla fareyi mikroskobun altına yerleştirin. Karaciğer dokusu, yeterli kan akışına sahip ve örnek perturbasyonunun minimum olduğu temsili alanlar belirlenerek harici bir beyaz ışık kaynağı kullanılarak gözle taranır. Deney kapsamında, CXCR6-GFP heterozigot farelere intravital TPLSM görüntüleme uygulanmıştır. Bazı farelere, akut karaciğer hasarı oluşturmak için intraperitonal tetraklorür enjeksiyonu yapılmıştır.GFP eksprese eden modal hücreler video ile takip edildi ve hücresel mobiliteye dair bir anlık görüntü elde etmek için izleri üst üste bindirildi. Ardından izler normalize edildi. Normal karaciğerlerde hücrelerin rastgele migrasyon modelleri sergilediği görüldü.CCI four enjekte edilen karaciğerlerde hücresel migrasyonda bozulma görülmüştür. Başlangıç noktalarından itibaren toplam yer değiştirme ölçüldüğünde, CCI four uygulamasından 36 saat sonra hepatosellüler hasar bölgesinde hücre hapsinin olduğu açıkça görülmüştür. Karaciğer hasarına bağlı migrasyon bozukluğu, tekil hücrelerin zaman içindeki migrasyon hızı grafiğe dökülerek de gösterilebilir; bu grafikte 18 saatten sonra kısmi bir durma ve 36 saat sonra tam migrasyonel durma gözlemlenmiştir.Göç eden hücrelerin hızındaki azalmanın, hücreler popülasyon olarak karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı olduğu da gösterilmiştir. Bu nedenle, bu yaklaşım gelişen karaciğer hastalığında hücre göçü ve konumlanmasındaki değişikliklerin takibi için uygundur. Bu videoyu izledikten sonra, bir farenin karaciğerinin intravital çok foton mikroskobisi için nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Burada sunduğumuz yöntem, sunduğumuz nazik fiksasyon tekniği sayesinde hareket artefaktlarını minimize etmemize ve hayvanın uzun süreli hayatta kalması için stabilize edilmesine olanak tanır. Maskeleme işleminden sonra, doğru şekilde uygulandığında bu teknik yaklaşık bir saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür sırasında hayvanların vücut sıcaklığı, kalp atış hızı, oksijen ve CO2 seviyeleri gibi hayati parametrelerinin kontrol edilmesi önemlidir. Bu, nekroz derinliğinin ve solunumun ayarlanmasıyla sağlanabilir. Bu tekniği takiben.İnfiltre olan bağışıklık hücrelerinin fenotipi veya gelişim sonrası doku veya infiltre olan hücreler tarafından salgılanan mediyatörler gibi ek soruları yanıtlamak için akış sitometrisi analizi veya lazer yakalama mikrodisseksiyonu gibi diğer prosedürler uygulanabilir. Bu teknikler, araştırmacıların karaciğerdeki lökosit trafiğinin dinamikleri ve hücresel etkileşimler hakkında bilgi edinmelerini sağlayarak enflamatuar karaciğer hastalıklarına yol açan olaylar dizisinin çözümlenmesine imkan tanımıştır. Çok foton mikroskobisi için kullanılan yüksek enerjili darbeli bir kızılötesi lazer ile görüntüleme yaparken lütfen lazer güvenlik kılavuzlarına uyunuz.Bu deneyi gerçekleştirirken, lazer radyasyonunun hiçbir yansımasının gözlerinize ve cildinize zarar vermediğinden emin olun.

long-term-intravital-multiphoton-microscopy-imaging-immune-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Biz sürekli fare mikroglia görselleştirme ve dolaşımdaki monositler için bir yöntem...

Kronik İki foton için İnce kafatası Pencere Tekniği In vivo</emNöro-inflamasyon Modelleri murin mikroglia> Görüntüleme

Bu makale, görüntü elde etme ve analiz için özel bir metodoloji ile birlikte intravital mikroskopi görüntüleme kullanılarak fare karaciğer damar sisteminin tek tek kan damarları içindeki kan akış hızının dinamik ölçümü ve miktarının belirlenmesi için ayrıntılı bir yöntem hakkında ayrıntılı bir yöntem hakkında rapor vermektedir.

Aşağıdaki Karaciğer intravital Mikroskopi Görüntüleme<em&gt; Leishmania</em&gt; Enfeksiyon: Karaciğer Hemodinami Üzerine Bir Değerlendirme

Mikroglia aktivasyonu ve mikroglioz kronik nörodejenerasyona önemli tepkilerdir. Burada, in vivo, konfokal oftalmoskopi retinal CX3CR1-GFP + mikroglial hücreleri uzun süreli görselleştirme için yöntemler sunmak ve eşik ve morfometrik için belirlemek ve aktivasyonunu ölçmek için analiz eder. Biz yaşa bağlı glokomun erken evrelerinde mikrogliyal değişiklikleri takip.

Fare Glokomda Konfokal Oftalmoskopik Görüntüleme ve Hücre morfometrisi: Nörodejenerasyonda sırasında Retina Mikroglial Aktivasyonu Vivo Dynamics

Anestezi uygulanmış farelerde intravital konfokal mikroskopi kullanarak kararlı durum ve enflamatuar koşullar altında mezenterik venlerdeki nötrofillerin ve monositlerin davranışını izlemek için bir protokolü detaylandırıyoruz.

Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme

Bir roman cerrahi protokol İki fotonlu görüntüleme en az invaze olan canlı fare karaciğer için kurduk. Bu teknik ile karaciğer detaylı yapısını lipopolysaccharide kaynaklı endotoksemi sırasında tespit. Biz bu yöntemi hepatik lökosit göç için çeşitli reaktifler tedavinin etkinliğini belirlemek için kullanılması gereken tahmin.

İki fotonlu Lipopolysaccharide tedavi fare karaciğer bağışıklık yanıtında sırasında lökositlerin Intravital görüntüleme

Bu deneyde, kuyruk damarına kan damarlarını lekeleyebilen Rhodamine B izotiyosiyanat-dektran enjekte edilir. Karaciğer açığa çıktıktan ve sabitlendikten sonra multifotoğraf mikroskopisi kullanılarak canlı vücuttaki derin dokuyu gözlemlemek için karaciğerin belirli bir kısmı seçilebilir.

Fare Karaciğer Dokusunda Damarların Multifotoğraf Mikroskobik Gözlemi

Bu protokol, nöro-glio-vasküler yapıların uzunlamasına görüntülemesi, hem sağlıklı hem de hastalıklı koşullarda fonksiyon ve fonksiyon için kullanılabilecek kronik bir kafatası pencere implantasyon tekniğini açıklamaktadır. Genellikle tercih edilirken bazı kritik sınırlamalara sahip olan transkraniyal görüntüleme yaklaşımına tamamlayıcı bir alternatif olarak hizmet vermektedir.

Farelerde Nöro-İmmün Dinamiğin Vivo Görüntülemesinde Tekrarlayan Performans için Hassas Beyin Haritalaması

Burada, doğrudan ilgilenilen dokuya/organa ve cilde yapıştırılabilen optik olarak net, silikon pencereler kullanılarak uzun süreli intravital görüntüleme için bir yaklaşım sunulmuştur. Bu pencereler şu anda sahada kullanılan diğerlerinden daha ucuz ve çok yönlüdür ve cerrahi yerleştirme hayvanlarda sınırlı iltihaplanma ve sıkıntıya neden olur.

Şeffaf Silikon Pencerelerle Uzunlamasına İntravital Görüntüleme

Burada, fare gözünün ön kamarasına aşılanmış karaciğer sferoidlerinin noninvaziv in vivo görüntülemesine izin veren bir platformu tarif ediyoruz. İş akışı, birincil karaciğer hücrelerinden sferoidlerin üretilmesinden fare gözüne transplantasyona ve konfokal mikroskopi ile hücresel çözünürlükte in vivo görüntülemeye kadar uzanır.

Fare gözünün ön kamarasına aşılanmış karaciğer sferoidlerinin in vivo görüntülenmesi

Burada, nakledilen farenin sol akciğerini iki foton mikroskobu kullanarak intravitalal olarak görüntülemek için bir protokol sunuyoruz. Bu, murin akciğer naklini takiben hücresel dinamikleri ve etkileşimleri gerçek zamanlı olarak incelemek için değerli bir araçtır.

Nakledilen Fare Akciğerinin İntravital İki Foton Mikroskobu

Bu protokol, sağlam karaciğer dokusunda karaciğer stellat hücrelerinin morfolojisini görselleştirmek ve modellemek için kapsamlı bir görüntüleme hattı sunar. Bu yaklaşım, fare genetiği kullanılarak fibroblastların floresan etiketlenmesini, yerinde karaciğer perfüzyon tabanlı doku hazırlığını ve modifiye edilmiş iDISCO doku temizleme yöntemini birleştirerek optik şeffaflığı sağlar.

Karaciğer Fibrozisi Fare Modellerinde Hepatik Yıldız Hücre Morfolojisinin Haritalanması

Öğrenin, fare karaciğerindeki lökosit göçünü ve etkileşimlerini intravital multiphoton mikroskopi ile uzun süreli görüntülemeyi. Bu yöntem, karaciğer inflamasyonunda immün hücre dinamiklerini incelemek için güçlü bir araç sunar.

CXCR6.Gfp Muhabir Fare kullanma Sağlıklı ve hastalıklı Karaciğer Bağışıklık Hücreleri Uzun Vadeli intravital multiphoton Mikroskopi Görüntüleme (Video) | JoVE Journal

CXCR6.Gfp Muhabir Fare kullanma Sağlıklı ve hastalıklı Karaciğer Bağışıklık Hücreleri Uzun Vadeli intravital multiphoton Mikroskopi Görüntüleme

Daha fazla video keşfet