Name: Photoconvertible PSmOrange Sistemi kullanılarak GFP transgenik zebrafish hücreleri izleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Keşfedin, PSmOrange sistemiyle GFP transgenik Danio rerio embriyolarında hücre izleme yöntemini. Bu teknik, gelişim biyolojisinde hücre kökenlerini ve davranışlarını canlı organizmada incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Orijinal H2B-PSmOrange plazmidini sağladığı için O. Subach'a ve balık bakımı için balık tesisi ekibimize teşekkür ederiz. Mikroskopi ekipmanına ve analiz yazılımına erişim için Heidelberg Üniversitesi'ndeki Nikon Görüntüleme Merkezi'ne minnettarız. CBTM'deki Mannheim Canlı Hücre Görüntüleme Çekirdek Tesisi'nin desteğini kabul ediyoruz (DFG INST 91027/10-1 FUGG). Bu çalışma, Excellenzcluster CellNetworks, EcTop Sinyalizasyon süreçlerinin uzaysal-zamansal koordinasyonu (EcTop 2), Heidelberg Üniversitesi'nden C.A.B. ve Heidelberg Üniversitesi Mannheim Tıp Fakültesi'ne ve DFG (FOR 1036/2, 298/3-1 ve 298/6-1) tarafından M.C. tarafından desteklenmiştir.

1. H2B-PSmOrange mRNA in vitro transkripsiyon ve mRNA Saflaştırma <ol><li> üreticinin talimatlarına uygun olarak Notl kısıtlama enzimi ile pCS2 plazmidi içeren H2B-PSmOrange linearize. Not: mRNA kontaminasyonu ve bozulmasını önlemek için eldiven ve laboratuvar kat olarak uygun korumaları kullanarak bir sonraki adımları gerçekleştirin. </li><li> üreticinin protokollerine göre olan bir PCR Saflaştırma kiti ya da fenol-kloroform göre yöntemler kullanılarak Doğrusal hale getirilen DNA saflaştırılır. </li><li> üreticinin talimatlarına göre Sp6-mRNA transkripsiyonu için doğrusallaştırılmış şablon DNA 1 ug kullanın. </li><li> 37 ° C&#39;de 10-20 dakika boyunca 1.0 U RNaz bilgilerini DNaseI eklenerek DNA çıkarın. </li><li> Bir RNA üreticinin protokolüne göre kiti temizlemek kullanarak mRNA temizleyin. </li><li> MRNA saflık ve konsantrasyon geliştirmek 6 ul sodyum asetat (3.0 M, pH 5.2) ve 150 ul% 96 ​​etanol eklenerek mRNA çökeltildi. m inkübeEn az 30 dakika boyunca ve 24 saat kadar, -20 ° C&#39;de ixed çözeltisi. </li><li> 4 ° C&#39;de 45 dakika boyunca 18,407 x g&#39;de çözelti eğirme mRNA toplayın. sıvı atılır ve 150 ul% 70 etanol içinde mRNA tekrar süspansiyon. Karıştırın ve 4 ° C sıcaklıkta ilave bir 15 dakika boyunca çözeltiden santrifüjlenir. , Sıvı atın buz üzerinde 5 dakika boyunca pelet kurutulur ve 20 ul ultra-saf RNazsız su içinde mRNA tekrar süspansiyon. </li><li> 100 mRNA seyreltme (99 ul ultra-saf RNazsız su içinde 1 ul mRNA) bir 1: fotometrik ölçümüyle mRNA konsantrasyonu ve saflığı değerlendirmek. </li><li> Kısa süreli depolama için, -20 ° C&#39;de mRNA çözüm tutun. Uzun süreli depolama için, -80 ° C mRNA tutun. </li></ol> Zebra balığı Embriyolar içine 2. H2B-PSmOrange mRNA Mikroenjeksiyon <ol><li> tg kullanarak enjeksiyon öncesi eşleyen gece çiftleşme kurmak (Foxd3: GFP); tg (FLH: GFP) çift transgenik balık (ya da diğer herhangi bir GFP transgenik balık). Bir boşluk koyarak ayrılmış balık bırakınAralarında çiftleşme kontrol etmek. </li><li> enjeksiyon sabah ayırıcı çıkarın ve 20 dakika süre ile balık eş sağlar. </li><li> süresi çiftleşme sırasında, 130 ug son konsantrasyona H2B-PSmOrange mRNA seyreltik / nl ve Microloader ucunu kullanarak mikroenjeksiyon, tüpün içine transferi 6 ul enjeksiyon çözeltisi (RNazsız su içinde). kalibre cam slayt ile enjeksiyon hacmi kontrol edin. 2 nl mRNA çözeltisi (260 pg) enjekte etmek için enjeksiyon basıncını ayarlayın. </li><li> 1x Embriyo (E3) orta içeren bir sterilize plastik petri kabına yumurta toplamak. </li><li> Bir plastik pastör pipet kullanarak bir enjeksiyon çanak 20 30 embriyoların transferi. </li><li> Tek hücreli aşamada 11&#39;de sarısı içine hücreye hücreye ya da hemen altında solüsyon içeren 2 nl mRNA enjekte edilir. </li><li> 1x E3 ortamı içeren bir petri-çanak içine Transferi enjekte embriyolar, döllenmemiş veya normal gelişim gösteren embriyolar kaldırmak ve 28 ° C&#39;de onları büyümek. Not: Işık koruma oembriyoların f deney boyunca gerekli değildir. </li><li> 1x E3 ortam içinde zebra balığı embriyolar kaldırın ve pigmentasyonu önlemek için gastrulasyon sonra 0.2 mM PTU (1-fenil-2 tiyoüre) ekleyin. Bakteriyel kontaminasyon tehlikesini en aza indirmek için günde iki kez orta değiştirin. </li></ol> 3. Embriyo Gömme <ol><li> GFP (yeşil) ve PSmOrange bir floresan lamba ve uygun emisyon filtreleri ile donatılmış bir binoküler mikroskop kullanılarak (kırmızı / turuncu) birlikte ifade embriyolar seçin. 1x E3 ortamı içeren steril bir petri kabına pozitif embriyolar aktarın. </li><li> Forseps 12 kullanarak bir stereomicroscope altında dechorionate embriyolar. </li><li> 1.0 ml ihtiva eden 1.5 ml bir tüp içinde transferi bir embriyo, bir kesme ucu pipet (P200) kullanarak, ultra saf su içinde hazırlanmış% 1.0 düşük erimeli agaroz (LM) önceden ısıtılmış. Not: 80 ° C LMA ısıtın ve embriyo yerleştirmeden önce, oda sıcaklığında 3-5 dakika boyunca soğumaya. </li><li> Bir içine 150 ul LMA embriyo transfercoverglass bölmeli ve ince bir plastik uç kullanılarak ters döndürülür konfokal lazer tarama mikroskobu A1R + (ya da uygun olan herhangi bir mikroskop) için tarif edilen deneyde embriyonun yönünü örneğin dorsal tarafına ayarlayın. LMA polimerize olduğunda, anestezi için 0.2 mM propiltiourasil&#39;in% 0.02 etil 3-aminobenzoat metansülfbnat (Tricaine) içeren balık su haznesi doldurun. </li><li> örnek görüntüleme önce Tricaine etkisini tespit etmek için 15 dakika bekleyin. Anestezi aydınlık aydınlatma ile donatılmış bir stereomikroskop kullanılarak izlenebilir embriyo hareketleri önler. Not: odaları iki kez tekrar edilebilir. </li></ol> 4. PSmOrange Fotoçevrim <ol><li> konfokal mikroskop altında örnek yerleştirin ve 488 nm ve sırasıyla GFP ve PSmOrange görüntüleme için 561 nm lazerler kullanarak photoconvert için bölgeyi tanımlamak için örnek tarayın. Not: ters sta üzerine ters konfokal lazer tarama mikroskobu A1R + kullanınge mikroskop görüntüleme yazılımı ile TiEcontrolled ve 488 nm, 561 nm ve Fotoçevrim ve görüntüleme için 640 nm lazer ile donatılmış. Bununla birlikte, uygulama kesinlikle uzun dönüşüm ve görüntüleme için bir lazer hattı mevcuttur Bu mikroskop ile sınırlı değildir. <ol><li> yerine 20X hava hedefi koydu (NA: 0.75; WD: 1,0 mm; FOV: 0.64 x 0.64 mm). </li><li> Fotoçevrim önce PSmOrange proteini tespit etmek için aşağıdaki mikroskop ayarları kullanın: 561 nm lazer, objektif üzerindeki odak düzleminde ölçülen 0.74 mW. Not: Bu, bu sistemde% 40 tekabül (Odak düzleminde ölçme etkili gücünü belirlemek için tek yoldur). değişebilir H2B-PSmOrange enjeksiyonları verimliliği gibi deneysel ihtiyaçlarına göre lazer gücünü ayarlayın. </li><li> ilgi alanı vurgulamak için yakınlaştırma faktörlerini ekleyin. Daha yüksek büyütme görüntü elde etme süresi ve bu nedenle fototoksisite azaltır. </li></ol></li><li> yapıyı kapsayan bir z-yığını Edinme488 nm ve sıralı mod (hat modu 1-&gt; 4) 561 nm lazerler kullanarak ilgi s. 1.0 ve 2.0 mikron arasında z-adım sabitleyin. Çizgi ortalama ve tarama frekans görüntü kalitesini optimize etmek için de kullanılabilir. </li><li> örnek Tarama ve photoconvert alanı vurgulamak için ilgi (ROI) aracı bölgeyi seçin. stimülasyon alanı olarak ROI sabitleyin. Fotoğraf Aktivasyon / Beyazlatma modülü seçin, ilgili kutucuğu işaretleyerek 488 nm lazer etkinleştirmek ve% 80 (objektif ölçülen 1 mW lazer gücü) için 488 nm lazer ayarlayın. 0.5 sn / Frame tarama hızını ayarlayabilirsiniz. </li><li> Fotoçevrim programı (ND Uyarım) açın ve Fotoçevrim ayarlarını belirtin. <ol><li> Fotoçevrim protokolünü belirtmek için &quot;Ekle&quot; komutu üzerine tıklayın. </li><li> &quot;Toplama / Stimülasyon&quot; menüsüne &quot;Toplama&quot; in &quot;Faz&quot; 1 Set ve görüntü sayısı &quot;Döngüleri&quot; menüsündeki Fotoçevrim önce elde edilecek göstermektedir. </li><li> St &quot;olarak ayarlayın&quot; Faz &quot;2imulation &quot;ve stimülasyon olayların sayısını girmek yapılacak. </li><li> Ayarı &quot;Faz&quot; 3 &quot;Faz&quot; 1. İsteğe bağlı için tarif edildiği gibi, görüntü alımı son turdan önce beklenecek süre girerek &quot;Faz&quot; 2 sonra bekleyen &quot;Faz&quot; takın. </li><li> Tüm parametreler ayarlandıktan sonra, uyarım ayarı uygulamak ve Fotoçevrim çalıştırın. Lazer gücü, değişebilir Fotoçevrim her tur için tarama ve adım sayısı sıklığı ve embriyoya embriyo farklıdır: edin. Bir ayar Tablo 1&#39;de gösterilmiştir ile başlayın. </li></ol></li><li> 488 nm, 561 nm ve yukarıdaki gibi ayarları uygulayarak 640 nm lazerler kullanarak nihai z-yığını edinin. (4.5 mW kadar) yüksek lazer gücünü kullanarak dönüştürülen PSmOrange görselleştirmek için 640 nm lazer ayarlayın. </li></ol> LMA 5. Dismount Embriyo <ol><li> mikroskop bölmeyi içeren embriyo çıkarın. Dikkatle agaroz u embriyo kaldırmakforseps şarkı. </li><li> Yeni bir steril plastik Petri-çanağı içine veya 1 x E3 ve 0.2 mM PTU içeren steril bir 6-yuvalı plaka içinde embriyo transferi. arzu edilen gelişme aşamasına kadar 28 ° C &#39;de embriyo inkübe edin. </li></ol> 6. Photoconverted PSmOrange proteini ifade eden hücrelerin kaderini analiz <ol><li> nokta 3.3 ve 3.4 bölümünde anlatıldığı gibi embriyo Yeniden embed. </li><li> konfokal mikroskop altında örnek yerleştirin ve ilgi (488 nm) GFP transgenik yapısında photoconverted hücreleri (640 nm) tanımlamak için örnek tarayın. </li><li> 488 nm, 561 nm ve sıralı mod (hat modu 1-&gt; 4) 640 nm lazerler kullanarak ilgi yapıları kapsayan bir z-yığını edinin. 1.0 ve 2.0 mikron arasında z-adım sabitleyin. Çizgi ortalama ve tarama frekans görüntü kalitesini optimize etmek için de kullanılabilir. </li><li> , Burada ko-ifade GFP ve photoconverted protein hücreleri belirlemek için, aşağıdaki yöntemlerden birini kullanabilirsiniz. <ol><li> Özel yapım otomatik Fiji GörüntüJ Makro 3 <ol><li> Convolve &quot;GaussianBlur&quot; eklentisi kullanarak orijinal yığın (→ Süreç → GaussianBlur → Filtreler) ve &quot;Görüntü Hesaplama&quot; eklentisi (→ Süreç → Görüntü Hesaplama) kullanarak orijinal pürüzsüz yığınları çıkarmak. ilgi yapılarını görselleştirmek ve analiz için hesaplama süresini azaltmak için bu adımı kullanın. </li><li> photoconverted hücreleri vurgulamak amacıyla yeşil ve uzak-kırmızı kanallara özgü eşikler uygulayın (→ Görüntü → → Eşiği ayarlayın). Uygun bir ayar ile eşik alanlarını tespit etmek için &quot;Parçacıklar Analiz&quot; aracını kullanın (→ Parçacıklar Analiz → Analiz). </li><li> &quot;Görüntü Hesaplama&quot; eklentisi açın ve sarı (→ Süreç → Görüntü Hesaplama) yeşil ve uzak-kırmızı kanalda örtüşen ROI&#39;ları görüntüler. </li></ol></li><li> 3D veri değerlendirme için mikroskop görüntüleme yazılımı <ol><li> yığını görüntülemek(3D Görselleştirme Menü → göster Ses Görünüm →) göstermek hacmi görünümü seçeneğini kullanarak 3D. Yeşil, kırmızı ve uzak-kırmızı kanalları seçmek parlaklık ve kontrast ayarı ve photoconverted alanı (Şekil 1) vurgulamak için 3D yığını kırpmak için grafik arayüzü kullanın. Not: Veri görüntü analizi için ortak yazılımların çoğu mevcuttur analiz etmek için benzer yöntemler. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Tracking+Using+Photoconvertible+Proteins+During+Zebrafish+Development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development.</a> J. Vis. Exp. (4350), (2012).</li>
<li>Subach, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoswitchable+orange-to-far-red+fluorescent+protein%2C+PSmOrange%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A photoswitchable orange-to-far-red fluorescent protein, PSmOrange.</a> Nature Methods. 8, 771-777 (2011).</li>
<li>Beretta, C. A., Dross, N., Bankhead, P., Carl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ventral+habenulae+of+zebrafish+develop+in+prosomere+2+dependent+on+Tcf7l2+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">The ventral habenulae of zebrafish develop in prosomere 2 dependent on Tcf7l2 function.</a> Neural Development. 8, 19(2013).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12651-12656 (2002).</li>
<li>Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mKikGR%2C+a+monomeric+photoswitchable+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein.</a> PLoS One. 3, e3944(2008).</li>
<li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nature Methods. 6, 131-133 (2009).</li>
<li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2+and+Dendra2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2.</a> Nature Protocols. 2, 2024-2032 (2007).</li>
<li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nature Methods. 6, 153-159 (2009).</li>
<li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297, 1873-1877 (2002).</li>
<li>Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+monomeric+photoactivatable+red+fluorescent+protein+for+two-color+super-resolution+sptPALM+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells.</a> J Am Chem Soc. 132, 6481-6491 (2010).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5150/zebrafish-breeding-and-embryo-handling ">http://www.jove.com/science-education/5150/zebrafish-breeding-and-embryo-handling </a> (2015).</li>
<li>Concha, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+tissue+interactions+across+the+dorsal+midline+of+the+forebrain+establish+CNS+laterality%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Local tissue interactions across the dorsal midline of the forebrain establish CNS laterality.</a> Neuron. 39, 423-438 (2003).</li>
<li>Auer, T. O., Duroure, K., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+conversion+of+eGFP-+into+Gal4-transgenic+lines+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated conversion of eGFP- into Gal4-transgenic lines in zebrafish.</a> Nature Protocols. 9, 2823-2840 (2014).</li>
<li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome Research. 24, 142-153 (2014).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322, 1065-1069 (2008).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

floresan gazetecilere taşıyan transgenik embriyolar embriyo gelişimini anlamak için temelde yardımcı olmuştur. Bununla birlikte, özellikle yapıların belirli bir görselleştirme kolaylaştırmak için promotörler için gerekli ihtiyaç vardır. Onların yokluğunda, araştırmacılar kendi ilgi yapısının kökeni ve gelişimi hakkında bilgi edinmek için bu tür floresan proteinleri Fotoçevrim gibi teknikler güveniyor. Bu da onun gelişiminde rol oynayan moleküler mekanizmaları tanımlamak için önemli bir ön koşuldur. Zebra balığı Alanında...

Üstel olarak gelişen görüntüleme teknikleri, yaklaşık dört ardışık güne kadar olan zaman dilimlerinde gelişimsel süreçleri takip etmeye izin verir3. Zebra balığı ve diğer birçok hayvan model sisteminde, görselleştirmeyi kolaylaştırmak için spesifik hücreler, dokular, aksonal veya vasküler yapılar transgenik yeşil veya bazen kırmızı veya sarı floresan proteinlerle işaretlenir. Bununla birlikte, çoğu transgenik hatta, transgen, ilgilenilen hücrelerde spesifik olarak ifade edilmez, aynı zamanda örneğin tek hücrelerin veya hücre gruplarının hassas bir şekilde izlenmesini engelleyen ek yapılarda da ifade edilir.
Floresan fotokonvertibl proteinler, embriyonik gelişim sırasında hücre takibi için çok uygundur. Bu tür proteinlerin uygulanması için ön koşullar, uzun ömürlü bir doğa, dönüşüm üzerine iyi ayrılmış bir emisyon aralığı ve parlak floresandır. Mevcut fotokonvertibl proteinler, Kaede4, KiGR5, mEos26, PS-CFP2 veya Dendra27 gibi dönüşüm sırasında emisyon aralıklarını değiştirenleri ve fotoaktive edildiğinde sadece floresan olan diğerlerini içerir (PAmCherry8, PAGFP9 veya PATagRFP10). Bununla birlikte, mevcut FP-transgenik hayvanlardaki hücreleri izlemek için uygulamaları, genellikle yeşil bir floresan durumu içerdikleri veya yukarıdaki kriterlerin tümünü karşılamadıkları için sınırlıdır. Kısa bir süre önce, Subach ve meslektaşları, fotokonversiyon üzerine emisyonunu turuncu / kırmızıdan uzak kırmızıya değiştiren ve farelere enjekte edilen kültür ve kültürlenmiş hücrelerdeki hücrelerde başarıyla uygulanan PSmOrange proteinini bildirdiler2.
Proteinin canlı bir embriyoda hücre takibi için uygunluğunu araştırmak için, nükleer etiketli H2B-PSmOrange'ın zebra balığı embriyolarına mikroenjeksiyonu için bir ifade yapısı oluşturduk. Proteinin, zebra balığı embriyonik gelişiminin ilk 4 (ve muhtemelen daha fazla) günü boyunca GFP transgenik arka planlarında başarılı hücre takibi için tüm ön koşulları yerine getirdiğini bulduk. Bu süre zarfında, hücre göçü olaylarının çoğu balıklarda tamamlanır ve bu da PSmOrange sistemini zebra balığı araç setine mükemmel bir katkı haline getirir.

<table><tbody><tr><td>PCR Arıtma Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transkripsiyon kiti</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MiniElute Temizleme kiti</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Plastik Pasteur</td><td>alfa laboratuvarları</td><td>LW4000</td><td></td></tr><tr><td>Orijinal H2B-PSmOrange Plazmid</td><td>Addgene</td><td>31920</td><td>Makalede açıklanan plazmit Carl laboratuvarında mevcuttur</td></tr><tr><td>FemtoJet Mikroenjektör</td><td>Eppendorf</td><td>5247 000.013</td><td></td></tr><tr><td>Forseps (5 Inox)</td><td>NeoLab</td><td>2-1633</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek II Odacıklı #1.5 Alman Kapak Camı Sistemi&nbsp;</td><td>Nunc</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R+</td><td>Nikon GmbH Almanya</td><td>Numara</td><td></td>Yok</tr><tr><td>Nikon PLAN Apo &lambda; 20X hava objektifi&nbsp;</td><td>Nikon GmbH Almanya</td><td>Numara</td><td></td></tr><tr><td>Yok NIS Elements AR Yazılımı (v. 4.30.02)</td><td>Nikon GmbH Almanya/Laboratuvar Görüntüleme Numara</td><td></td><td></td> Yok</tr></tbody></table>

photoconvertible psmorange sistemi kullanılarak gfp transgenik zebrafish hücreleri izleme

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Şeffaf zebra balığı embriyolarının (Danio rerio) hücre ve dokuların floresan etiketlemeleri ile birlikte hızlı gelişimi, gelişimsel süreçlerin canlı hayvanda olduğu gibi görselleştirilmesini sağlar. İlgilenilen hücreler, transgenik hatların oluşturulması için bir floresan proteinin (FP) ekspresyonunu sağlamak için dokuya özgü bir promotör kullanılarak etiketlenebilir. Bu amaçla floresan fotokonvertibl proteinlerin kullanılması, ayrıca ekspresyon alanı içinde tanımlanmış yapıların hassas bir şekilde izlenmesine izin verir. İlgilenilen bölgedeki proteini aydınlatmak, emisyon spektrumunu değiştirir ve diğer transgenik hücreleri orijinal renklerinde bırakarak belirli bir hücreyi veya hücre kümesini vurgular. Önemli bir sınırlama, zebra balığında çok sayıda doku için bilinen promotörlerin olmamasıdır. Tersine, gen ve güçlendirici tuzak ekranları, çoğunlukla GFP veya daha az genişletilmiş kırmızı veya sarı FP'ler ile kelimenin tam anlamıyla tüm embriyonik yapıları ayrı ayrı etiketleyen muazzam transgenik kaynaklar üretmiştir. Bu tür transgenik arka planlarda tanımlanmış yapıları takip etmek için bir yaklaşım, ek olarak, ilgilenilen hücre(ler)de dönüştürülebilen, her yerde bulunan fotokonvertibl bir proteini dahil etmek olacaktır. Bununla birlikte, mevcut fotokonvertible proteinler yeşil ve/veya daha az sıklıkla kırmızı emisyon durumu1 içerir ve bu nedenle genellikle mevcut transgenik hatların FP arka planındaki hücreleri izlemek için kullanılamaz. Bu sorunu aşmak için zebra balığı2,3 için PSmOrange sistemini kurduk. Bu proteinin nükleer bir formunu kodlayan sentetik mRNA'nın basit mikroenjeksiyonu, tüm hücre çekirdeklerini turuncu / kırmızı floresan ile etiketler. Proteinin hedeflenen fotodönüşümü üzerine, emisyon spektrumunu uzak kırmızıya değiştirir. Proteinin kuantum verimliliği ve kararlılığı, PSmOrange'ı zebra balığı ve muhtemelen diğer teleost türleri için mükemmel bir hücre izleme aracı haline getirir.

Şekil 1, PSmOrange Fotoçevrim sisteminin bir örneğini göstermektedir. epifiz kompleks omurgalı dorsal diensefalon korunmuş bir yapıdır. diğer omurgalılarda olduğu gibi, bu karmaşık diensefalon ve sol parapineal hücrelerin merkezinde epifiz organı oluşur. Zarif ama zaman alıcı uncaging deneyler parapineal hücreler epifiz organı 13 ön kısmında menşeli olduğu görüldü. TG (Foxd3 GFP); tg (FLH: GFP) transgenik embriyolar, epifiz ve parapineal hem hücrelerin gelişim...

GFP transgenik arka planlarında in vivo hücre takibi için güçlü, basit ve uygun maliyetli bir araç olarak fotoconvertible PSmOrange sistemini kurduk. Bu protokol, zebra balığı model sistemindeki uygulamasını açıklar.

Photoconvertible PSmOrange Sistemi kullanılarak GFP transgenik zebrafish hücreleri izleme

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

PSmOrange Foto Dönüşüm Teknolojisinin genel amacı, embriyonik gelişim ve hastalık sırasında canlı hayvandaki hücreleri takip etmektir. Bu yöntem, doku ve organlara dönüşen hücrelerin kökeninin ortaya çıkarılması gibi gelişimsel biyolojideki temel soruları yanıtlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, GFP transgenik arka planlarda uygulanabilmesidir.Bu yöntem; rejenerasyon, tümör progresyonu ve invazyon gibi farklı araştırma alanlarında da uygulanabilir. Metin protokolüne uygun olarak PSmOrange ve GFP eksprese eden embriyolar üretilip gömüldükten sonra, embriyoyu konfokal mikroskobun altına yerleştirin ve fotokonversiyon uygulanacak alanı belirlemek için örneği taramak amacıyla 20x hava objektifi ile 488 ve 561 nanometre lazerleri kullanın. Fotokonversiyon öncesinde PSmOrange proteinini saptamak için, objektifin üzerindeki odak düzleminde ölçülen 0,74 miliwatt gücündeki 561 nanometre lazeri kullanın ve lazer gücünü gerektiği şekilde ayarlayın.İlgi alanını vurgulamak, görüntüleme süresini kısaltmak ve fototoksisiteyi azaltmak için yakınlaştırma faktörlerini ayarlayın. 488 ve 561 nanometre lazerleri ardışık modda ve 1.0 ile 2.0 mikrometre arasında bir Z adımı kullanarak, ilgi duyulan yapıları kapsayan bir Z yığını edinin. Görüntü kalitesini optimize etmek için hat ortalamasını ve tarama frekansını ayarlayın.Ardından örneği tarayın ve ROI'yi (ilgi alanı) belirleme aracını kullanarak, ROI'yi stimülasyon alanı olarak sabitlemeden önce fotokonvertasyon yapılacak bölgeyi vurgulayın. Fotoaktivasyon ağartma modülünü seçin, 488 nanometre lazeri etkinleştirmek için ilgili kutucuğu işaretleyin, ardından 488 nanometre lazeri %80'e ve tarama hızını çerçeve başına 0,5 saniyeye ayarlayın. Sonrasında, fotokonversiyon aracını açın ve fotokonversiyon protokolünü belirtmek için 'Ekle'ye tıklayın.Kazanım stimülasyon menüsünde, Birinci Faz'ı (Phase One) kazanım (acquisition) olarak ayarlayın ve döngüler menüsünde, fotokonversiyon öncesinde kazanılacak görüntü sayısını belirtin. İkinci Faz'ı (Phase Two) stimülasyon olarak ayarlayın ve gerçekleştirilecek stimülasyon olaylarının sayısını girin. Üçüncü Faz'ı (Phase Three), Birinci Faz için açıklandığı şekilde düzenleyin.İsteğe bağlı olarak, son görüntüleme turundan önce beklenecek süreyi girerek Faz İki'den sonra bir Bekleme Fazı ekleyin. Parametreler ayarlandıktan sonra, stimülasyon ayarını uygulayın ve fotokonversiyon işlemini başlatın. Mikroskobik ayarlar, PSmOrange fotokonversiyonu için kritik öneme sahiptir.Başarılı bir fotokonversiyon sağlamak için, fotokonverte olmuş PSmOrange proteinini tespit etmek amacıyla deneyden hemen sonra embriyodan görüntü alınır. Konversiyon başarılı değilse, prosedür tekrarlanır. 488, 561 ve 640 nanometre lazerleri kullanarak ve 640 nanometre lazeri 4,5 milliwatt'a kadar olan yüksek güce ayarlayarak, az önce açıklanan ayarlar ile son bir z-stack görüntüleme gerçekleştirin.Embriyoyu yerinden çıkarmak için hazneyi mikroskoptan çıkarın ve embriyoyu agarozdan ayırmak için pens kullanın. Embriyoyu, E3 içerisinde 0.2 millimolar PTU içeren yeni sterilize edilmiş plastik bir petri kabına veya sterilize edilmiş 6 kuyucuklu plakaya aktarın. Embriyoyu, istenen gelişim evresine gelene kadar 28 degrees Celsius'de inkübe edin. Fotokonvert edilmiş PSmOrange protein eksprese eden hücrelerin akıbetini analiz etmek için, embriyoyu metin protokolüne uygun olarak yeniden gömün.Konfokal mikroskop altında, ilgilenilen GFP transgenik yapısındaki fotokonvertlenmiş hücreleri belirlemek için numuneyi tarayın. Yapıları kapsayacak şekilde, ardışık modda 1 ila 2 mikrometre sabit aralıklı bir z-yığını (z stack) elde etmek için 488, 561 ve 640 nanometre lazerleri kullanın. Image J Fiji yazılımını kullanarak, GFP ve fotokonvertlenmiş proteini birlikte eksprese eden hücreleri tanımlayın.Orijinal yığını çoğaltın, yumuşatılmış yığınları orijinalinden çıkarmak için Gaussian Blur eklentisini ve görüntü hesaplayıcıyı (image calculator) kullanın. Fotokonverte hücreleri belirginleştirmek için yeşil ve uzak kırmızı kanallara belirli eşik değerleri uygulayın. Ardından, yeşil kanaldaki eşik alanlarını uygun bir ayarla tespit etmek için Analyze Particles aracını kullanın.Bu adımı uzak kırmızı kanal için tekrarlayın. Ko-lokalize olan hücreleri tespit etmek için görüntü hesaplayıcı (image calculator) eklentisini açın. Analyze Particles aracını kullanarak, yeşil veya uzak kırmızı kanaldaki örtüşen ROI'leri sarı renkte görüntüleyin.NIS-Elements yazılımını kullanarak 3D veri değerlendirmesini gerçekleştirin ve Show Volume View seçeneğini kullanarak yığını 3D olarak görüntüleyin. Ardından, yeşil, kırmızı ve uzak kırmızı kanalları seçmek, parlaklığı ve kontrastı ayarlamak ve fotokonverte olmuş alanı vurgulamak için 3D yığını kırpmak amacıyla grafik arayüzünü kullanın. Burada, zebra balığı transgenik FOXD3 yüzen baş GFP embriyolarındaki PSmOrange fotokonversiyon sistemine ait bir örnek gösterilmektedir.Döllenmeden 26 saat sonra, pineal bezin anterior kısmındaki iki hücre kümesi fotokonverte edilmiş ve hemen görüntülenmiştir. Protein, 640 nanometrelik uzak kırmızı lazerle tespit edilmiş ancak 561 nanometrelik lazerle tespit edilememiştir. Bu hücrelerde, fotobleşleme nedeniyle başlangıçta GFP ekspresyonu azalmıştır.52 HPF'de, fotokonvert edilmiş H2B PSmOrange proteinini eksprese eden hücrelerde GFP ve H2B PSmOrange tespit edildi. Bu hücrelerin bir kısmı beynin sol tarafında parapineal organı oluşturdu. Bu sonuç, anterior pinealdeki parapineal hücre kökenine ilişkin önceki raporlarla tutarlıdır ve PSmOrange tekniğinin canlı GFP transgenik omurgalı embriyosundaki uygulanabilirliğini göstermektedir.Bu prosedürün ardından, hücre gelişiminin temelini oluşturan moleküler hiyerarşilerle ilgili ek soruları yanıtlamak amacıyla, genetik olarak manipüle edilmiş embriyolarda hücre izleme analizi gerçekleştirilebilir.

tracking-cells-gfp-transgenic-zebrafish-using-photoconvertible

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Multiphoton mikroskobu optik derin penetrasyon ve azaltılmış fototoksisite düşük enerjili fotonların kontrol sağlar. Biz zebrafish embriyolar canlı hücre etiketlenmesi için bu teknolojinin kullanımını anlatmayacağız. Bu protokol fotoğraf indüksiyonu için çeşitli ışık duyarlı moleküllerin kolayca adapte edilebilir.

Canlı Zebra balığı Embriyolar iki-Foton-Tabanlı fotoaktivasyon

Bu protokol bir konfokal lazer tarama mikroskobu, floresan proteinleri Fotoçevrim gerçekleştirmek için genel bir yaklaşım açıklar. Biz Fotoçevrim puried protein örneklerinin yanı sıra, mOrange2 ve Dronpa canlı hücreleri çift prob, optik vurgulama için prosedürler açıklanmaktadır.

Canlı Hücrelerde Floresan Proteinleri ve Çift prob Optik Vurgulama Saf, Fotoçevrim

Bu video, çok renkli konfokal zaman atlamalı görüntüleme ve hedeflenen hücre ablasyon teknikleri verilmektedir. Time-lapse görüntüleme ilgi birden fazla hücre tiplerinin davranışlarını izlemek için...

Transgenik Zebra balığı Multicolor Time-lapse Görüntüleme: Hedefli Nöronal Hücre Ablasyon aktifleşir görselleştirme Retina Kök Hücreler

Safir femtosaniye lazer osilatör: Ti bir yöntem olup, bir iki-fotonlu emme ile bir kafes floresan proteini içeren tek bir hücre photoactivate için tarif edilmiştir. Kader haritası için fotoaktive hücre, immunohistokimya kullanılır. Bu teknik, her hücre tipi için de uygulanabilir.

Zebra balığı Tek Hücre Kader Haritalama

Burada, canlı zebra balığı embriyosunda fotokonverte edilebilir floresan proteinlerin (PCFPs) fotoaktive anahtarlaması ve fotokonverte edilmiş proteinin gelişim sırasındaki belirli zaman noktalarında takibi için bir yöntem sunmaktayız. Bu metodoloji, canlı bir omurgalı organizmadaki farklı gelişimsel süreçlerin temelini oluşturan hücre biyolojik olaylarının izlenmesine olanak tanır.

Zebra balığı Geliştirme Sırasında Photoconvertible Proteinler kullanma Cep Takip

Bu video, fotokonvertibl yeşil floresan proteini eksprese eden transgenik zebra balığı larvaları kullanılarak lökosit alımının izlenmesini göstermektedir. Kırmızı floresan boya etiketli bakterilerin otik veziküle önceden enjekte edilmesi ve fotokonversiyonun indüklenmesi, lökositlerin göçünün, fagositozunun ve vücut boyunca dağılmasının gözlemlenmesini sağlayarak bağışıklık tepkisi dinamikleri hakkında değerli bilgiler sağlar.

Bakteriyel Enfekte Transgenik Zebra Balıklarında Fotokonversiyon Tabanlı Lökosit Takibi

Somitogenesis ritmik bir gelişimsel süreç olduğu mekansal desenler, embriyonun vücut ekseni. Daha önce, biz bu süreci götürmek döngüsel genleri gözlemlemek için floresan gazetecilere kullanmak transgenik zebra balığı hatları geliştirdik. Burada, kültür in vitro zamanla bu satırları ve görüntü onların salınımların hücreleri dağınık.

Tek Hücrelerde Zebra balığı Segmentasyon Clock Görüntüleme Dağınık Presomitic Mesoderm Hücre Kültürleri Üretimi

Burada, nasıl hücre photoconversion floresan protein, Eos, yaşayan hayvanlarda ifade belirli alanlara UV Işınlarına maruz kalma yoluyla elde edilir göstermek için bir iletişim kuralı mevcut.

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Bu iletişim kuralı Kaede yaşayan endocardial hücreleri floresan proteinin photoconversion için bir yöntemi açıklar endocardial hücreleri izleme Atriyoventriküler kanal ve Atriyoventriküler kalp kapak geliştirme sırasında sağlar Zebra balığı embriyo .

Zebra balığı embriyo hücre Photoconversion ile aşağıdaki Endocardial doku hareketleri

Biz birincil hücre kültürleri zebra balığı embriyo transfection ve canlı hücre görüntüleme gibi primer hücre--dan yetişkin zebra balığı beyin hazırlamak için bir protokol için hazırlanması için etkili ve kullanımı kolay bir protokol mevcut.

Kültür ve zebra balığı primer hücre Transfection

Bu protokol, sinir sistemi gelişimi sırasında H 2 O2'ninfizyolojik sinyal rollerini değerlendirmek için kültürlü zebra balığı nöronlarında ve larvalarında genetik olarak kodlanmış bir hidrojen peroksit (H 2 O2)-biyosensör kullanımını açıklar. Farklı hücre tiplerine uygulanabilir ve genel gelişimde reaktif oksijen türlerini (ROS) incelemek için deneysel tedavilerle değiştirilebilir.

Nöronal Gelişim Sırasında ROS Canlı Hücre Görüntüleme

Keşfedin, PSmOrange sistemiyle GFP transgenik Danio rerio embriyolarında hücre izleme yöntemini. Bu teknik, gelişim biyolojisinde hücre kökenlerini ve davranışlarını canlı organizmada incelemek için kullanılır.

Photoconvertible PSmOrange Sistemi kullanılarak GFP transgenik zebrafish hücreleri izleme

Daha fazla video keşfet