Name: Ivacaftor, büyük metabolitleri ve Lumacaftor Kistik fibrozis hastalarının biyolojik sıvı içinde klinik örnekler yüksek üretilen iş analizi için en iyi duruma getirilmiş LC-MS/MS yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Keşfedin, kistik fibrozis ilaçlarının farmakokinetiğini anlamak için ivacaftor, metabolitleri ve lumacaftorun eşzamanlı analizinde optimize edilmiş HPLC-MS yöntemini. Bu güvenilir teknik, terapötik ilaç izleme için basit ve hızlı bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JL ve T.V. Ulusal Enstitüsü alerji ve bulaşıcı hastalıklar (NIAID), Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 AI111965) tarafından desteklenir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Enstitüsü alerji ve bulaşıcı hastalıklar veya Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor. MC bir Avustralya NHMRC asıl araştırma görevlisi olduğunu. J. L. bir Avustralya Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi (NHMRC) üst düzey araştırma görevlisi, ve T.V. bir Avustralya NHMRC sanayi Kariyer Gelişim düzeyi 2 araştırma görevlisi. E.K.S ASM (Mikrobiyoloji American Society) için atanan bir genç Büyükelçi 2017 ve Avustralya yüksek lisans Ödülü tarafından desteklenmektedir. Bu eser bölümlerini Kistik fibrozis içinde Melbourne (5-8inci Ağustos 2017) Australiasian Konferansı 12inci sunuldu.

etik onaya Monash Üniversitesi insan araştırma Etik Komitesi (MUHREC üzerinden) elde edilen.
 1. testin uygulama: hasta örnek toplama <ol><li>ne zaman hasta kendi standart doz 150 mg ivacaftor ya da ivacaftor 125 mg /lumacaftor süresini kaydetmek 200 mg.</li>
	<li>Not aşağı ne zaman hasta kan örneği toplanır tam zamanı. 
	Not: 24 h saat boyunca 4-5 örnek toplama önerilir. Sadece bir örnek topluluğu mümkün ise, C max konsantrasyonları kararlı duruma, sonra ulaşılabilir olacak gibi belirtilen süre 2,5-4 h mesaj ivacaftor veya ivacaftor-lumacaftor birlikte dozaj noktasıdır &#62; 5 gün üst üste tedavi.</li>
	<li>4-5 mL kan ticari olarak mevcut tedavi edilmezse mavi tüpler toplamak.</li>
	<li>Tam kan toplandıktan sonra bu rahatsız edilmeden oda sıcaklığında bırakarak pıhtısı kan izin. 
	Not: Bu genellikle 15-30 dk. sürer</li>
	<li>1.000-2.000 x g soğutmalı santrifüj 4 ° C'de 10 dakika için de centrifuging tarafından pıhtıyı. Elde edilen süpernatant plazma atayın.</li>
	<li>Santrifüjü hemen süpernatant (plazma) Pasteur pipet kullanarak temiz polipropilen boru aktarın. Plazmanın tüp hastanın kimliği ile (örneğin, hasta 1), (örneğin, ivacaftor-lumacaftor birlikte) yönetilen uyuşturucu ve hasta örnek zaman etiket vardı toplanan (örneğin, 2,5 h sonrası doz).</li>
	<li>2-8 ° C'de koru örnekleri işleme sırasında. İşlem tamamlandığında, örnekleri, saklamak &#8211; 20 ° C.</li>
	<li>Gerekirse, gemi örnekleri çözümlenirken Enstitüsü için onaylanmış bir kurye ile. 
	Not: Örnekleri kuru buza gelinceye kadar sevk mi edileceğine ve yönü muhafaza edilmelidir &#8211; 80° C kadar analiz.</li>
</ol> 2. Hazırlama ve işleme sonucunda oluşan örnekleri ve standartlar Not: ivacaftor/lumacaftor tedavi için gelen sağlıklı bağış saf plazma Avustralya Kızıl Haç üzerinden elde edilen. Bütünlüğü sağlamak amacıyla, tüm örnekleri/standartlarını toplama ve işleme sırasında 2-8 ° C'de tutulmaları gerekir. İşlem tamamlandığında, örnekleri, saklamak &#8211; 20 ° C.
<ol><li>IVA, IVA-karboksilat, hydroxymethyl-IVA ve kendi standartlarına için bir başvuru olarak hizmet edecek LUMA tartmak.</li>
	<li>Hazırlamak her analit (IVA, M1, M6 ve LUMA) LC-MS sınıf metanol 100 µg/mL ve 10 µg/mL içinde iki bağımsız hisse senedi çözüm. 
	Not: Benchtop üzerinde 10 gün sonra bileşikler tarihi:.</li>
	<li>Taze hazırlamak LC-MS kalibrasyon standartları her analitik çalışma önce kalibrasyon standartları seyreltme tarafından hisse senedi çözümler içine insan plazma konsantrasyonları elde etmek için: 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2.5, 5.0 ve 10.0 µg/mL. Bu örnekler standartları olarak adlandırılır.</li>
	<li>Protein çökelti, %0,1 formik asit (FA) Asetonitril (ACN, LC-MS sınıf) hazırlamak ve ihtiyaç kadar buzdolabında bekletin.</li>
</ol> 3. Sonucunda oluşan örnekleri ve standartları ön arıtma <ol><li>oda sıcaklığında equilibrate her iki hasta ve boş plazma numuneleri izin.</li>
	<li>Plazma örnekleri 15 karıştırmak için girdap s örnek başına.</li>
	<li>100 µL aliquot standartları için boş ya da plazma veya hasta numuneleri analiz için 1.5 mL polipropilen microcentrifuge tüp içine transfer.</li>
	Her standart tüpler içine iç standart IVA <li>ekleyin (örneğin, 0,01, 0,025, 0,05, 0.1, 0,2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 ve potansiyel konsantrasyon aralığı kapsayacak şekilde 10.0 µg/mL), kapağını kapatın ve 2-3 s. Not iç standart için girdap olduğunu sadece boş plazma eklendi ve iç standart hasta numuneleri eklenir.</li>
	<li>Tekrarlama adım 3.4. diğer iç standartları için M1, M6 ve LUMA.</li>
	<li>Kısaca kapağını yok damlacıkları olduğundan emin olmak için her tüp aşağı döndür.</li>
	<li>Eklemek 200 µL % 0,1 karışımı plazma proteinleri çökelti ACN her tüpün içine SK.</li>
	<li>Girdap karışımı yaklaşık 15 için şiddetle s.</li>
	<li>Tüplere 10 dk buzdolabında stand izin.</li>
	<li>Santrifüj kapasitesi 10.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de mümkünse.</li>
	<li>200 µL aliquot süpernatant, bir 13 mm şırınga ile 1,5 mL HPLC şişe filtre.</li>
	<li>Transfer 100 µL süpernatant HPLC-MS analizi için LC-MS şişe içine,.</li>
</ol> 4. HPLC-MS analizi Not: HPLC-MS analizi triple quadrupole Kütle Spektrometre (Tablo 1) ile birleştiğinde bir LC-MS sistem performansı.
<ol><li>Çevirmek LC-MS sistemde örnekleri ile tepsi içinde otomatik örnekleyici yerleştirin.</li>
	<li>Bir bekçi sütun için sütun ekleyin ve LC-MS sisteme bağlayın.</li>
	<li>Mobil aşama her iki şişe takın (A: şişe %100 ACN; B: %0,1 formik asit su şişe) ve LC-MS sistem equilibrate.</li>
	<li>Aşağıdaki parametreleri LC-MS Protokolü dahil.
	<ol><li>Bir 2:1 oranında Kütle Spektrometre girmeden önce mobil faz akış bölme (atık: MS giriş).</li>
		<li>0,5 mL/dk su %100 ACN ve %0,1 formik asit oluşan bir mobil faz kullanarak akış hızında bir degrade elüsyon gerçekleştirmek (başlangıç noktası, 40:60, v/v). Mobil faz hacmi yüzde analizi değişiklikleri Not.</li>
		<li>Kütle Spektrometre olumlu electrospray iyonlaşma modunda işletmek.</li>
		<li>LC-MS ayarları aşağıdaki gibi olduğundan emin olun: iyon sprey gerilim 4.5 kV, çarpışma enerji 295.9 gaz nebulizing V: azot 3 L/min; çarpışma gaz: argon; 20 L/dk akış, lens gerilim Q3 kurutma gaz:-22 V, desolvation sıcaklık ısı blok ile 250 ° C Sıcaklık 400 ° C.</li>
		<li>Enjekte 10 µL birim örnek başına.</li>
		<li>Birden fazla reaksiyon (MRM) izleme kullanarak Algıla analitler. M/z 392.49 iyon geçişleri izlemek &#8594; 393, m/z 408.49 &#8594; 409, m/z 422.47 &#8594; 423 ve m/z 452.40 &#8594; 453 IVA, IVA-M1, IVA-M6 ve LUMA, sırasıyla. 
		Not: Yeni en iyi duruma getirilmiş yöntemi henüz tam olarak FDA standartlarına göre doğrulanması gerekiyor.</li>
	</ol></li></ol> 5. Kalibrasyon eğrileri <ol><li>Yapı LC-MS kalibrasyon eğrileri daha önce en yüksek alan oranları her birinin iç standart dört analitler ve kalibrasyon standart nominal konsantrasyonları arasındaki ilişkiyi kullanarak her analitik çalışma ivacaftor (IVA-M1, IVA-M6 veya LUMA) LC-MS ayarları uygulaması içinde. 
	Not: Kalibrasyon eğrisi inşaatı tüm adımları LC-MS ekipman kullanılan model üzerinde bağlıdır. Bu bilgiler ekipman el kitabında kullanımına sunulabilir.</li>
	<li>1/C 2 konsantrasyonları karşılıklı göre ağırlık tarafından doğrusal en küçük kareler regresyon çözümlemesi yapma.</li>
</ol>

<ol><li>Schneider, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-drug+plasma+protein+binding+interactions+of+ivacaftor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Recognit%22%5BJournal%5D)">Drug-drug plasma protein binding interactions of ivacaftor.</a> J Mol Recognit. 28 (6), 339-348 (2015).</li>
<li>Solomon, M., Leatte, P. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSolomon%2C+M+%22Treatments+for+Cystic+fibrosis%22">Treatments for Cystic fibrosis</a>. , (2009).</li>
<li>O'Sullivan, B. P., Flume, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+approach+to+lung+disease+in+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">The clinical approach to lung disease in patients with cystic fibrosis.</a> Semin Respir Crit Care Med. 30 (5), 505-513 (2009).</li>
<li>Ramsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CFTR+potentiator+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation.</a> N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).</li>
<li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumacaftor-Ivacaftor+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis+Homozygous+for+Phe508del+CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR.</a> N Engl J Med. 373 (3), 220-231 (2015).</li>
<li>Hadida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+N-%282%2C4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl%29-4-oxo-1%2C4-dihydroquinoline-3-carboxamide+%28VX-770%2C+ivacaftor%29%2C+a+potent+and+orally+bioavailable+CFTR+potentiator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery of N-(2,4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl)-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide (VX-770, ivacaftor), a potent and orally bioavailable CFTR potentiator.</a> J Med Chem. 57 (23), 9776-9795 (2014).</li>
<li>FDA. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22FDA+Advisory+Commitee+Briefing+Material+VERTEX-FDA+Pulmonary-Allergy+drugs+advisory+commitee%22">FDA Advisory Commitee Briefing Material VERTEX-FDA Pulmonary-Allergy drugs advisory commitee</a>. 98 , VERTEX Pharmaceuticals Incorporated. (2015).</li>
<li>Holmes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((False+dawn+for+cystic+fibrosis+disease+modifiers%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">False dawn for cystic fibrosis disease modifiers?</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (10), 713-714 (2014).</li>
<li>Veit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+gating+potentiators%2C+including+VX-770%2C+diminish+DeltaF508-CFTR+functional+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Some gating potentiators, including VX-770, diminish DeltaF508-CFTR functional expression.</a> Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297(2014).</li>
<li>Cholon, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiator+ivacaftor+abrogates+pharmacological+correction+of+DeltaF508+CFTR+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Potentiator ivacaftor abrogates pharmacological correction of DeltaF508 CFTR in cystic fibrosis.</a> Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297(2014).</li>
<li>EMA, <a target="_blank" href="http://www.ema.europa.eu/ema/index.jsp?curl=pages/medicines/human/medicines/003954/human_med_001935.jsp&mid=WC0b01ac058001d124">Assessment report ORKAMBI (ivacaftor/lumacaftor) European medicines agency</a>. , (2015).</li>
<li>VERTEX. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Vertex+prescribing+infomation%22">Vertex prescribing infomation</a>. , (2015).</li>
<li>Matthes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+free+drug+concentration+prevents+inhibition+of+F508del+CFTR+functional+expression+by+the+potentiator+VX-770+%28ivacaftor%29%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Low free drug concentration prevents inhibition of F508del CFTR functional expression by the potentiator VX-770 (ivacaftor).</a> Br J Pharmacol. 173 (3), 459-470 (2016).</li>
<li>Schneider, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+HPLC+and+LC-MS%2FMS+methods+for+the+analysis+of+ivacaftor%2C+its+major+metabolites+and+lumacaftor+in+plasma+and+sputum+of+cystic+fibrosis+patients+treated+with+ORKAMBI+or+KALYDECO%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chrom+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Development of HPLC and LC-MS/MS methods for the analysis of ivacaftor, its major metabolites and lumacaftor in plasma and sputum of cystic fibrosis patients treated with ORKAMBI or KALYDECO.</a> J Chrom B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1038, 57-62 (2016).</li>
<li>Su, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+LC-MS%2FMS+method+for+the+quantitation+of+cabozantinib+in+rat+plasma%3A+application+to+a+pharmacokinetic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">An LC-MS/MS method for the quantitation of cabozantinib in rat plasma: application to a pharmacokinetic study.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 985, 119-123 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Have için ilk geliştirilen ve HPLC ve LC-MS yöntemi hızlı algılama ve ivacaftor ve onun büyük metabolitleri hydroxymethyl-IVA M1 (etkin) ve IVA-karboksilat M6 (etkin değil); miktar için doğrulanmış önceden bildirildiği gibi bizim grup ve lumacaftor plazma ve balgam CF hastalarda14. Bizim grup daha önce rapor tahlil başarıyla LUMA, IVA, IVA-M1 ve IVA-M6 plazma konsantrasyon ve kararlı duruma standart tedavi IVA 150 mg /q12 s ile geçiren CF hastalarda balgam ölçmek için kullanılan (Latince terminolo...

Kistik fibroz (CF) akciğer, karaciğer, pankreas ve akciğer fonksiyon ve pankreas yetmezliği1, bir düşüş gibi ilerici çoklu organ yetmezliği neden bağırsak ekzokrin mukus bezlerinin içeren yaygın bir genetik hastalık olduğunu 2,3. Ivacaftor (IVA) ilk gıda ve İlaç İdaresi (FDA-ABD) ve Avrupa ilaç Ajansı (EMA) Kistik fibrozis trans-membran gürültülerinden regülatörü (CFTR) güçlendiricisini uyuşturucu, önemli bir üretim kanıtladığı klinik etkinlik ile kabul G551D-CFTR taşıyan CF hastalarda Akciğer işlev üzerinde küçük bir alt plasebo iyileşme [glisin (G) 551 konumda yerine aspartik asit (D)] missense mutasyon (CF nüfusunun % ~ 4-5)4,5. Bu sözlü CFTR kanal açma, böylece artan klorid iyon akışı ve CF4,6klinik tablo açar birincil defekt hareket eden uyuşturucu artar yönetilen. Ne yazık ki, IVA tedavinin etkili hastalarda daha sık homozigoz F508del mutasyon [içinde çerçeve silme fenilalanin (F) 508 konumda kaybolmasına neden CFTR gen] ile değil hangi ~ 50 %'görülür misfolded CFTR sonuçları CF nüfus7,8.
Son zamanlarda, FDA ilaç lumacaftor IVA CFTR düzeltici ile birleştirmek için onay verdi. F508del-CFTR CFTR kanal etkinlik, potentiates bir modülatör (IVA) ile hücre yüzeyine kurtarır CFTR düzeltici (lumacaftor, LUMA) birleştirme akıllı strateji etkili tedavi pencere CF nüfusu5 çoğu için genişletir . Soru çelişkili raporlar bir dizi bu dökme şüphe onların klinik etkinlik9,10üzerine ortaya çıktı gibi olup bu ilaçlar verdikleri sözü yerine getireceğiz üzerinde kalır. Ayrıca, akciğer işlev gelişmeler sadece mütevazı (2.6-%4 ivacaftor-lumacaftor kombinasyon için) idi IVA tedavinin G551D mutasyon (10,6-%12,5)8taşıyan hastalarda ile elde başarı ile karşılaştırıldığında. IVA ve LUMA klinik etkinliğinin karşılaştırılması ivacaftor-lumacaftor birlikte potansiyel sınırlayan arasındaki potansiyel antagonistik ilaç-ilaç etkileşimleri ideal daha az farmakokinetik özellikleri7,11gel. IVA kapsamlı öncelikle bir aktif metaboliti hydroxymethyl-IVA (IVA-M1, M1) ve etkin olmayan bir form IVA-karboksilat (IVA-M6, M6)7,12sitokrom P450 enzimleri (CYP), tarafından metabolize. CYP3A4 uyarıcı LUMA, öte yandan, değil kapsamlı olarak metabolize ve büyük ölçüde dışkı11' değişmeden atılır. CYP3A4 indükleyicileri sitokrom metabolizma teşvik gibi ivacaftor (CYP3A4 substrat) konsantrasyonları azaltılabilir. Ayrıca, IVA ve LUMA çok hidrofobik moleküller ve ~ %99 için plazma proteinleri, hangi önemli ölçüde ücretsiz (aktif) ilaç konsantrasyonu1,13sınırlar bağlıdır.
Toplu olarak, bu faktörler birlikte ivacaftor-lumacaftor birlikte klinik etkinliğinin sınırlamak için gelmiş olabilir. En iyi plazma konsantrasyonları ivacaftor-lumacaftor kombinasyon için geçerli doz rejimi altında elde olup olmadığını veya tedavi eşik8korunur bilinmemektedir. Halen, tepe gibi farmakokinetik parametreleri ile ilgili bilgiler bir yetersizliği ve kararlı durum plazma konsantrasyonları ivacaftor veya ivacaftor-lumacaftor olduğunu. Ünlü metabolizma ivacaftor ve lumacaftor göz önüne alındığında, pozlama-yanıt ilişkilerini izleme ivacaftor veya ivacaftor-lumacaftor tedavisi için en uygun doz rejimleri elde etmek için gerekli olduğunu. Bizim grup IVA ve LUMA14pozlama-yanıt ilişkilerini izlemek için ilk HPLC/LC-MS yöntem son zamanlarda yayınlanan. Bugüne kadar ivacaftor, onun metabolitleri ve lumacaftor konsantrasyonları ölçme alternatif hiçbir teknikleri bildirilmiştir. Daha büyük bir hasta toplu yüksek üretilen iş analizine izin vermek için ve analiz süresini önemli ölçüde azaltmak için bizim grup bir daha küçük gözenek boyutu ters faz Kromatografi sütun ve bir degrade çözücü sistemi kullanılarak bildirilen yöntemi en iyi duruma getirilmiş bu maliyet ve çalışan kez azaltır.

<table><tbody><tr><td>IVA (Kedi # S114)&nbsp;</td><td>SelleckChem (ABD).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LUMA (Kedi # S1565) &nbsp;</td><td>SelleckChem (ABD).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVA-karboksilat (Kat# 510242247CS)&nbsp;</td><td>Clearsynth (Kanada).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hidroksimetil-IVA (Kedi # 510240849CS)&nbsp;</td><td>Clearsynth (Kanada).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol (MeOH, LC-MS sınıfı),&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>asetonitril (ACN, LC-MS sınıfı)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>formik asit (FA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>üçlü dört kutuplu Shimadzu 8030 LC-MS&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenomenex Kinetex (2.6 & mikro; m C8 100 &Aring;; 50 ve kez; 2,1 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(KrudKatcher Ultrea HPLC Sıralı Filtre 0,5 m Derinlik Filtresi x 0,004 inç).&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL polipropilen mikrosantrifüj tüpü (VWR).&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Santrifüj 5430</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>13 mm şırınga filtresi (0,45 & mikro; m naylon, GRACE, ABD)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 & L, PTFE / Silikon septa].&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ivacaftor, büyük metabolitleri ve lumacaftor kistik fibrozis hastalarının biyolojik sıvı içinde klinik örnekler yüksek üretilen iş analizi için en iyi duruma getirilmiş lc-ms/ms yöntemi

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Kusurları Kistik fibrozis trans-membran gürültülerinden regülatör (CFTR) Kistik fibrozis (CF), pulmoner bulgular hayati bir hastalığa neden olur. Ivacaftor (IVA) ve ivacaftor-lumacaftor (LUMA) kombinasyonu doğrudan faaliyet ve arızalı CFTR proteini kaçakçılığı modüle iki yeni atılım CF ilaçlardır. Ancak, hala bir kıtlık farmakokinetik/Farmakodinamik Parametrelerdeki anlayış ve Farmakoloji, ivacaftor ve lumacaftor yoktur. İvacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-karboksilat ve lumacaftor hastalarda standart ivacaftor veya ivacaftor-lumacaftor kombinasyon biyolojik sıvı içinde konsantrasyonları eşzamanlı analizi için HPLC-MS tekniği Terapi oldu daha önce bizim grubu tarafından geliştirilen ve kısmen FDA standartlarına doğrulanmıştır. Ancak, hasta örnekleri daha çok sayıda yüksek üretilen iş analizine izin vermek için bizim grup bildirilen yönteminin kullanılmasıyla bir daha küçük gözenek boyutu ters faz Kromatografi sütun en iyi duruma getirilmiş (2.6 µm, C8 100 Å; 50 x 2.1 mm) ve bir degrade çözücü sistemi ( 0-1 dk: %40 B; 1-2 dk: 40-%70 B; 2-2.7 min: %70 B; düzenlenen 2.7-2.8 min: 70-%90 B; 2.8-4.0 min: %90 B çamaşır; 4.0-4.1 min: 90-%40 B; 4.1-6.0 min: %40 B düzenlenen) bir isocratic elüsyon yerine. Bu çalışmanın amacı sadece 6 dk çok sayıda hasta numuneleri analiz için gerekli olan örnek başına önemli ölçüde ~ 15 dk örnek başına HPLC-MS analiz süresini azaltmak için oldu. Bu amaca uygun yöntem bu atılım CF ilaçların pozlama-yanıt ilişkilerinin içine çalışmaları için önemli yardımcı olacaktır.

Son zamanlarda su (40:60 %100 ACN ve %0,1 formik asit oluşan mobil faz ile C8 sütun (5 µm, 3.9 mm x 50 mm kimlik) kullanarak kısmen bir triple quadrupole LC-MS ve HPLC Dedektör sistemi, FDA standartlarına doğrulanmış bir yöntem bildirdin v/v) 1 mL/dk akış hızında. Doruklarına doğrusal bir ilişki tüm metabolitleri, ivacaftor, IVA-M1, IVA-M6 ve lumacaftor14insan plazma 10 µg/ml 0,01 bir konsantrasyon aralığında gözlendi. Burada bu yöntem optimize edilmiş önemli ölçüde izin vermek için LC saklama kez...

Ivacaftor ve ivacaftor-lumacaftor iki yeni CF ilaç bileşimidir. Ancak, hala bir kıtlık PK/PD ve Farmakoloji anlayış yoktur. Biz ivacaftor ve onun büyük metabolitleri ve lumacaftor aynı anda analizi için en iyi duruma getirilmiş bir HPLC-MS tekniği mevcut.

Ivacaftor, büyük metabolitleri ve Lumacaftor Kistik fibrozis hastalarının biyolojik sıvı içinde klinik örnekler yüksek üretilen iş analizi için en iyi duruma getirilmiş LC-MS/MS yöntemi

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Bu, plazma analizi için örnek hazırlama protokolüdür. Bütünlüklerini korumak için tüm örneklerin ve standartların toplama ve işleme sırasında 2 ila 8 °C'de tutulması gerektiğini lütfen unutmayın. İşlemler tamamlandıktan sonra tüm örnekleri -20 °C'de saklayın.Standart hazırlama için, her bir anilid, ivacaftor, M1 metaboliti, M6 metaboliti ve lumacaftor'ün metanol içinde 100 µg/mL ve 10 µg/mL konsantrasyonlarında iki bağımsız stok çözeltisini hazırlayın. Bileşiklerin oda sıcaklığında 10 gün sonra miyadının dolduğunu lütfen unutmayın. Standartlar için, 1,5 mL'lik polipropilen mikro santrifüj tüplerine 100 µL insan plazması aktarın.Diğer tüm numuneleriniz için aynı işlemi tekrarlayın. Ardından, her tüpe iç standart ekleyin. Örneğin, hazırlanmış standarttan 0.01 µg/mL seçiyoruz.Şu anda bu tüp, iç standart eklenmiş plazma içermektedir. Diğer tüm standartlar için de aynı şekilde devam edin. Standartlarınızı alın ve tüm sıvının tüpün dibinde olduğundan emin olmak için birkaç saniye boyunca santrifüjleyin.Buna tüm 40 standart için devam edin. Hasta örnekleri için, hasta örneği tüpünden 100 µL'yi mikro santrifüj tüpüne aktarın. Gerçek hasta örneğine iç standart eklenmez.Tüm sıvının tüpün dibinde olduğundan emin olmak için hasta örneğini birkaç saniye boyunca santrifüjleyin. Sonraki adımlar hem örnekler hem de standartlar için tasarlanmıştır. Plazma proteinlerini çöktürmek için her bir örnek tüpüne 200 µL %0,1 formik asit içeren acetonitrile ekleyin.Tüm standartlar ve hasta örnekleri için aynı işlemi tekrarlayın. Her örneği yaklaşık 15 saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin. Tüm standartlar ve gerçekleşmiş örnekler (incurred samples) için bu işlemi sürdürün.Çökelmeyi kolaylaştırmak için buzdolabında 10 dakika bekletin. Gösterim amaçlı olarak, yalnızca bir örneği ve bir standardı santrifüj edeceğim. Eppendorf Centrifuge 5430 cihazında, dört derecede, 10.000 rpm hızda 10 dakika boyunca santrifüjleme yapıyoruz.Şimdi süpernatantı Phenomenex viallerine filtreleyeceğiz. Bunun için ABD'den satın alınan 0,45 mikrometre naylon Grace filtreli 13 milimetrelik şırınga filtresi kullanıyoruz ve 1,5 mililitre hacmindeki HPLC viallerine filtrasyon yapıyoruz. Filtrasyon sonrası, LC/MS analizi için 100 mikrolitre süpernatantı LC/MS viallerine aktaracağız.Bu örnek artık analiz için hazırdır. Şimdi tüm örneklerinizi tüp rafına yerleştirmeniz yeterlidir. Üçlü kuadrupol kütle spektrometresi ile entegre edilmiş bir Shimadzu 8030 LC/MS sistemi kullanıyoruz.Analizden önce sistemin dengelenmesini bekleyin. Yaklaşık 15 dakika süren dengeleme işlemi tamamlandığında, Start düğmesine basın. Her bir metabolit için, anilidlerin pik alanı oranlarını kalibrasyon standartlarının nominal konsantrasyonuna karşı grafikleyerek bir kalibrasyon eğrisi oluşturun.Örnekteki anilid konsantrasyonlarını hesaplamak için kalibrasyon eğrisinin regresyon denklemini kullanın. Tipik bir kromatogram bu şekilde gösterilmiştir. Phenomenex Kinetex C8 kolonunda, %100 asetonitril ve su içinde %0,1 formik asitten oluşan bir mobil faz ile gradyan elüsyon kullanılarak optimize edilmiş kromatografik çözünürlük elde edilmiştir.LC alıkonma süreleri şu şekildeydi. M6 için bir dakika. M1 için 1,3 dakika.Ivacaftor için 1,55 dakika, lumacaftor için 2,3 dakikadır. Tüm boş plazma örneklerinde, anilidlerin alıkonma sürelerinde herhangi bir girişim gözlenmediği gibi, ivacaftor ile lumacaftor kombinasyonundan kaynaklanan bir girişim de saptanmamıştır.Çok sayıda hasta örneğinin yüksek kapasiteli analizi sayesinde, mevcut izokratik elüsyon yerine daha küçük gözenek boyutuna sahip bir ters faz kromatografi kolonu olan Phenomenex C8 kolonu ve gradyan çözücü sistemi kullanarak raporladığımız yöntemi optimize ettik. Bu işlem, yıkama aşaması dahil olmak üzere örnek başına çalışma süresini altı dakikaya indirmektedir. Güvenilir ve özgün olan bu yöntem; ivacaftor ve ivacaftor-lumacaftor kombinasyonunun biyolojik sıvılardaki terapötik ilaç izlemi için basit, hassas ve hızlı bir yaklaşım sunmaktadır.İlaç etkinliğini maksimize etmek ve sağlık hizmetleri maliyetlerini kontrol altında tutmak için maruz kalma-yanıt ilişkileri geliştirme ihtiyacı göz önüne alındığında, CF hastası olan hastalarda kanıta dayalı tedavilerin ve yüksek kapasiteli analitik tekniklerin kullanımı konusunda klinisyenlere yardımcı olacak daha hassas araçların geliştirilmesi ve valide edilmesi gerekmektedir. Önerilen analitik yöntemin klinik farmakokinetik ve farmakodinamik çalışmalara uygulanmasıyla, ivacaftor veya ivacaftor-lumacaftor kombinasyonunun farmakokinetik parametrelerinin daha geniş bir hasta grubu üzerinde daha detaylı araştırılmasına olanak sağlanacaktır.

optimized-lc-msms-method-for-high-throughput-analysis-clinical

Research

JoVE Journal

Medicine

Kütle spektrometresi (UPLC-MS) ile birleştirilmiş ultra performanslı sıvı kromatografisi ile hedeflenmemiş metabolit profili, metabolizmayı araştırmak için güçlü bir tekniktir.  Bu makale, numune organizasyonu ve hazırlama, veri toplama, veri analizi, kalite kontrol ve metabolit tanımlaması dahil olmak üzere serumun hedeflenmemiş metabolit profili için kullanılan tipik bir iş akışını özetlemektedir.

Ultra Performans Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (UPLC-MS) ile Serum Büyük Ölçekli Sigara hedefli metabolomik Profilleme

Burada, basit bir manuel protein çökeltme adımı ve çevrimiçi kolon ekstraksiyonu kullanarak kurutulmuş kan lekelerinde immünosupresan takrolimusun miktarını belirlemek için yüksek performanslı bir sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (HPLC-MS/MS) testini açıklıyoruz.

LC-MS / MS kullanarak Kurutulmuş Kan Spotlar Immünosupresan Tacrolimus Niceleme

In vitro sistemlerin Metabolik yetkinlik ilaç ve toksik maddelerin biyotransformasyonu ve dışa atılması için önemli bir gereksinimdir. Bu protokol, biz Hücre kültürlerinde metabolizma faz değerlendirmek için referans metabolik sondaları uygulanmasını açıklar.

Kütle Spektrometre ve lüminojenik tabanlı Yaklaşımlar Faz I Metabolik Yetkinlik ait Characterize<em&gt; İn Vitro</em&gt; Hücre Kültürleri

Burada, LC/MS analizi ile birleştiğinde lazer yakalama mikrodiseksiyon dağınık şekilde ölçmek-akciğer tüberkülozu granülomlar içinde uyuşturucu dağıtımı için bir iletişim kuralı'nı açıklar. Yaklaşım ilaç konsantrasyonları yüksek uzaysal detay dokularda miktarının için geniş uygulanabilirliği vardır.

Akciğer tüberkülozu lezyonlar lazer ilaçların kayma miktar yakalamak mikrodiseksiyon sıvı Kromatografi Kütle spektrometresi (LCM-LC/MS)

Burada biz bir yüksek-den geçerek yöntemi ile kalite kontrol multisegment enjeksiyon-kılcal göre geliştirilmiş çözünürlük ve ilaç kötüye kullanımı ve bunların metabolitleri büyük paneller tespiti için sağlar kapsamlı uyuşturucu gözetimi için tarif Elektroforez-kütle spektrometresi.

Multisegment enjeksiyon-kılcal Elektroforez kütle spektrometresi kullanılarak yüksek üretilen iş ve kapsamlı uyuşturucu gözetim

Tanı parçalanma, MZmine uygulanan filtreleme, bilinen ve bilinmeyen doğal ürünlerin tüm sınıflar için LC-MS/MS veri kümeleri ekrana zarif, post-edinme yaklaşımdır. Bu araç, analistin bileşiklerin tüm sınıfı için teşhis olarak tanımladığı ürün iyonlarına ve/veya nötr kayıplara yönelik MS/MS spektrumlarını arar.

LC-MS/MS tanılama parçalanma filtreleme ile doğal ürün keşfi: Microcystin analizi için uygulama

Burada, hücre siz protein sentezi reaksiyonlarında merkezi karbon ve enerji metabolizmasında yer alan 40 bileşiği ölçmek için sağlam bir protokol salıyoruz. Hücresiz sentez karışımı ters fazlı sıvı kromatografi kullanılarak etkili ayrıştırma için anilin ile türevize edilir ve daha sonra izotopik olarak etiketlenmiş iç standartlar kullanılarak kütle spektrometresi ile ölçülür.

Ters Faz Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Ile Hücresiz Protein Sentezmetabolizmasının Mutlak Niceliği

Hastaların kompleks ilaca dirençli tüberküloz (DR-TB) rejimlerine bağlılığını analiz etme yöntemleri yanlış ve kaynak yoğun olabilir. Yöntemimiz, 11 DR-TB ilaç konsantrasyonları için kolayca toplanan ve depolanan bir matris olan saçı analiz eder. LC-MS/MS kullanarak, uyuşturucuya bağlılığı daha iyi anlamak için kullanılabilen alt nanogram ilaç düzeylerini belirleyebiliriz.

Küçük Saç Örneklerinde 11 İlaca Dirençli TB İlaçların Ölçülmesi için Doğrulanmış LC-MS/MS Paneli

Burada, tek bir dörtlüktolü kütle spektrometresi ile birlikte sıvı kromatografisi ile analiz edilen kanser hücre kültürlerinden toplanan ortamda kynurenine pathway'de (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, ksantürenik asit, 3-hidroksiranilik asit) üretilen dört farklı triptofan metabolitinin belirlenmesi için bir protokol açıklanmıştır.

Kanser Hücre Kültürlerinden Toplanan Ortamda Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi ile Analiz Edilen Seçilmiş Kynureninlerin Eşzamanlı Nicelemesi

Protokoller, karmaşık lisat bazlı hücre içermeyen sistemlerde metabolik reaksiyonları incelemek için kırma indeksi veya kütle spektrometrik tespiti ile birleştiğinde yüksek performanslı sıvı kromatografi yöntemlerini açıklar.

Sıvı Kromatografisi, Lysate Tabanlı Hücre içermeyen Sistemlerde Metabolit Profilleme için Kırılma İndeksi veya Kütle Spektrometrik Algılaması ile Birleştirilmiştir

Keşfedin, kistik fibrozis ilaçlarının farmakokinetiğini anlamak için ivacaftor, metabolitleri ve lumacaftorun eşzamanlı analizinde optimize edilmiş HPLC-MS yöntemini. Bu güvenilir teknik, terapötik ilaç izleme için basit ve hızlı bir yaklaşım sunar.

Ivacaftor, büyük metabolitleri ve Lumacaftor Kistik fibrozis hastalarının biyolojik sıvı içinde klinik örnekler yüksek üretilen iş analizi için en iyi duruma getirilmiş LC-MS/MS yöntemi (Video) | JoVE Journal

Ivacaftor, büyük metabolitleri ve Lumacaftor Kistik fibrozis hastalarının biyolojik sıvı içinde klinik örnekler yüksek üretilen iş analizi için en iyi duruma getirilmiş LC-MS/MS yöntemi

Daha fazla video keşfet