Name: Memeli Hücrelerinde Havuzlu CRISPR Tabanlı Genetik Ekranlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 s
Description: Keşfedin havuzlu CRISPR-Cas9 genetik ekranlarını memeli hücrelerinde fonksiyonel genomik çalışmalar için. Bu yöntem, genom çapında gen fonksiyonlarını sistematik olarak inceleyerek bağlama özgü temel genleri belirlemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Genom Kanada, Ontario Araştırma Fonu ve Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri (MOP-142375, PJT-148802) tarafından desteklenmiştir.

Aşağıda özetlenen deneyler, enstitünün Çevre Sağlığı ve Güvenliği Ofisi yönergelerine uymalıdır.
1. Havuzlu CRISPR sgRNA lentiviral kütüphane plazmid amplifikasyon
<ol><li>Hazır CRISPR sgRNA plazmid DNA kitaplığını TE'de 50 ng/μL'ye seyreltin (örn. TKOv3).</li>
	<li>Elektro-yetersiz hücreleri kullanarak kütüphaneyi elektroporate. Aşağıda açıklandığı gibi toplam dört elektroporasyon reaksiyonu ayarlayın.<ol>
<li>2 μL 50 ng/μL TKO kitaplığına 25 μL çözülmüş elektroyit hücrelerini önceden soğutulmuş cuvettelere (1,0 mm) buz üzerinde ekleyin.</li>
		<li>Üreticiprotokolü tarafından önerilen optimum ayarları kullanarak elektroporate. Darbenin 10 s içinde, cuvette için Kurtarma Orta (veya SOC orta) 975 μL ekleyin.</li>
		<li>Elektrohaplı hücreleri bir kültür tüpüne aktarın ve 1 mL Kurtarma Ortamı ekleyin. 37 °C'de 1 saat için 250 rpm bir sallayarak inkübatör tüpleri.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kitaplığı titretlemek ve dönüşüm verimliliğini tahmin etmek için bir seyreltme plakası ayarlayın.<ol>
<li>8 mL'lik tüm hücreleri birleştirin ve iyice karıştırın. Havuzlanmış hücrelerin 10 μL'sini 800 kat seyreltme için 990 μL'lik Kurtarma Ortamı'na aktarın ve iyice karıştırın.</li>
		<li>Önceden ısıtılmış 10 cm LB + carbenicillin (100 μg/L) agar plaka üzerine seyreltmenin 20 μL'si. Bu dönüşüm verimliliğini hesaplamak için kullanılacak dönüştürücülerin 40.000 kat seyreltilmesi ile sonuçlanır.</li>
		<li>Toplam 20 önceden ısıtılmış 15 cm LB + carbenicillin agar plakası boyunca her plakaüzerinde kurtarılan hücrelerin plaka400 μL' si. Plakaları 30 °C'de 14-16 h'ye inkübedin. NOT: Bu düşük sıcaklıktaki büyüme, uzun terminal tekrarları (LTR)18arasındaki rekombinasyon en aza indirir.</li>
		<li>Dönüşüm verimliliğini hesaplamak için, 40.000 kat seyreltme plakası üzerindeki koloni lerin sayısını sayın (adım 1.3.2). Tüm plakalarda toplam koloni sayısını elde etmek için 40.000 ile sayılan kolonilerin sayısını çarpın. Toplam koloni sayısı sgRNA başına en az 200x koloniye eşdeğer bir kitaplık kapsamını temsil ediyorsa devam edin (en uygun u500-1000x).<ol>
<li>Örneğin, TKOv3 kütüphanesi (71.090 sgRNA) için en az koloni numarası 1.4 x 107'dirve bu sayı sgRNA başına 200x koloniye eşittir. Koloni temsili yetersizse, minimum kütüphane kapsamını elde etmek için seyreltme plakasındaki kolonilerin sayısına bağlı olarak 1.2.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aşağıda açıklandığı gibi kolonileri hasat<ol>
<li>Her 15 cm plaka için, 7 mL LB + carbenicillin (100 μg/L) orta ekleyin, sonra bir hücre yayıcı ile kolonileri kazıyın. 10 mL'lik pipetle, kazınmış hücreleri steril 1 L konik şişeye veya şişeye aktarın.</li>
		<li>Bir kez daha 5 mL LB + carbenicillin orta ile plakayı durulayın ve çözeltiyi şişeye aktarın.</li>
		<li>Tüm tabaklar için 20 tabaktan steril bir şişeye hücreleri bir araya getirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Toplanan hücreleri oda sıcaklığında 1 saat (RT) boyunca bir karıştırma çubuğuyla karıştırarak hücre kümelerini ayırın. Hücreleri önceden tartılmış santrifüj şişelerine ve 7.000 x g'de pelet bakterisine aktarın, sonra da ortamı atın.</li>
	<li>Isliç hücre peletini tartın ve ıslak peletin son ağırlığını belirlemek için santrifüj şişesinin ağırlığını çıkarın. Her sütunun işleyebileceği bakteriyel pelet miktarına bağlı olarak bir maxi veya mega ölçekli plazmid arıtma kiti kullanarak plazmid DNA arındırın.</li>
</ol>2. Büyük ölçekli CRISPR sgRNA kütüphane lentivirus üretimi
NOT: Protokolün bu bölümündeki tüm adımlar Sınıf II, Tip A2 biyogüvenlik kabininde bir BSL2+ tesisinde gerçekleştirilir.
<ol><li>Virüs üretimi için gereken 15 cm plaka sayısını, genellikle 15 cm'lik bir plakadan 18 mL virüs hasat edildiği tahminine göre hesaplayın.</li>
	<li>Hek-293T ambalaj hücrelerini düşük antibiyotikli büyüme ortamlarında (DMEM + FBS + isteğe bağlı: 0,1x kalem/strep) 15 cm'lik plaka başına 8 x 106 hücrede 20 mL'lik ortama tohumlayarak hücreleri transfeksiyona hazırlayın. 37 °C, %5 CO2'de</li><li></li><li></li><li> </li><li></li><li><li></li><li><li></li><li></ol><ol><li><ol><li><li></ol></li><li><ol><li></li><li><li><li> &lt;</li></ol></li><li>&lt;</li></ol><ol><li><li><li><li></li><li><li></li><li><li><li></ol><ol><li><ol><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li><li><li><li> </li><li></li><li></ol></li><li><ol><li><li><li> <img alt="Denklem: MOI = tarama başına toplam hücre sayısı ÷ kontrol plakasındaki toplam hücreler; deneysel hesaplama." src="/files/ftp_upload/59780/59780eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> <img alt="Katlama kapsama formülü: (son MOI × enfekte olmuş hücreler) ÷ sgRNA kütüphane boyutu; Bilimsel hesaplama." src="/files/ftp_upload/59780/59780eq2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"></li><li></li><li><li><li></ol></li><li><ol><li></li><li>&lt;</li><li></ol></li><li></li></ol><ol><li><ol><li><li><li><li><li><li></li><li> </li><li></li><li><li></li><li><li><li></li><li></ol></li><li><ol><li><li><li></li><li><li></li><li><li><li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li><li><li></li><li></li><li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li> </li></ol></li></ol><ol><li><li> <img alt="Genetik veri analizi için sgRNA formülüne göre normalleştirilmiş okumalar, hesaplama yöntemini gösterir." src="/files/ftp_upload/59780/59780eq3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 3"></li><li>&lt;</li><li><https:><https:></https:></https:></li><li><li> </li></ol>

<ol><li>Jiang, F., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+Structures+and+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms.</a> Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).</li>
<li>Baliou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+therapeutic+tools+for+complex+genetic+disorders+and+cancer+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review).</a> International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+CRISPR+Screens+Reveal+Fitness+Genes+and+Genotype-Specific+Cancer+Liabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities.</a> Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).</li>
<li>Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+CRISPR%2FCas9+and+RNAi+screens+for+essential+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).</li>
<li>Evers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+knock-out+screening+outperforms+shRNA+and+CRISPRi+in+identifying+essential+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).</li>
<li>Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design%2C+execution%2C+and+analysis+of+pooled+in+vitro+CRISPR%2FCas9+screens%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens.</a> The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).</li>
<li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li>
<li>Sanson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+libraries+for+CRISPR-Cas9+genetic+screens+with+multiple+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities.</a> Nature Communications. 9 (1), 5416(2018).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Design+of+Genome-Wide+CRISPR%2FSpCas9+Knock-out+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%7CGenomes%7CGenetics%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).</li>
<li>Mair, B., Tomic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+gene+profiles+for+human+pluripotent+stem+cells+identify+uncharacterized+genes+and+substrate+dependencies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies.</a> Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).</li>
<li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knock-out+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li>
<li>Sharma, S., Petsalaki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+CRISPR-Cas9+Based+Genome-Wide+Screening+Approaches+to+Study+Cellular+Signalling+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li>
<li>Steinhart, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+CRISPR+screens+reveal+a+Wnt-FZD5+signaling+circuit+as+a+druggable+vulnerability+of+RNF43-mutant+pancreatic+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors.</a> Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Essentiality+Profiling+Reveals+Gene+Networks+and+Synthetic+Lethal+Interactions+with+Oncogenic+Ras%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras.</a> Cell. 168 (5), 890-903 (2017).</li>
<li>Zimmermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+screens+identify+genomic+ribonucleotides+as+a+source+of+PARP-trapping+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions.</a> Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).</li>
<li>Deans, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+shRNA+and+CRISPR-Cas9+screens+enable+antiviral+drug+target+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification.</a> Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).</li>
<li>Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STBL2%3A+an+Escherichia+coli+strain+for+the+stable+propagation+of+retroviral+clones+and+direct+repeat+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Focus%22%5BJournal%5D)">STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences.</a> Focus. 16, 78-80 (1994).</li>
<li>Hart, T., Moffat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAGEL%3A+a+computational+framework+for+identifying+essential+genes+from+pooled+library+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens.</a> BMC Bioinformatics. 17, 164(2016).</li>
<li>Wang, G. Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+drug-gene+interactions+from+CRISPR+knock-out+screens+with+drugZ%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ.</a> bioRxiv. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://doi.org/10.1101/232736">https://doi.org/10.1101/232736</a> (2017).</li>
<li>Pedregosa, F. V., G,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scikit-learn%3A+Machine+Learning+in+Python%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Machine+Learning+Research%22%5BJournal%5D)">Scikit-learn: Machine Learning in Python.</a> Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).</li>
<li>Ketela, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+platform+for+highly+multiplexed+mammalian+functional+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens.</a> BMC Genomics. 12, 213(2011).</li>
<li>Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Am+I+ready+for+CRISPR%3F+A+user%27s+guide+to+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Genetics%22%5BJournal%5D)">Am I ready for CRISPR? A user's guide to genetic screens.</a> Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).</li>
<li>Hartenian, E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screens+and+functional+genomics+using+CRISPR%2FCas9+technology%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology.</a> FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAGeCK+enables+robust+identification+of+essential+genes+from+genome-scale+CRISPR%2FCas9+knock-out+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens.</a> Genome Biology. 15 (12), 554(2014).</li>
<li>Sheel, A., Xue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Amplifications+Cause+False+Positives+in+CRISPR+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens.</a> Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).</li>
<li>Meyers, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+correction+of+copy+number+effect+improves+specificity+of+CRISPR-Cas9+essentiality+screens+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells.</a> Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).</li>
<li>Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+arrayed+CRISPR-Cas9+library+targeting+epigenetic+regulators%3A+from+high-content+screens+to+in+vivo+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays.</a> Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.

Kullanım kolaylığı ve yüksek esnekliği sayesinde CRISPR teknolojisi hassas genom düzenleme için tercih edilen bir araç olarak yaygın olarak benimsenmiştir. Havuzlu CRISPR taraması, tek bir deneyde binlerce genetik tedirginliği sorgulamak için bir yöntem sağlar. Havuzlu ekranlarda, sgRNA kitaplıkları moleküler barkod görevi görehizmet eder, çünkü her dizi benzersizdir ve hedeflenen genle eşlenir. Genomik DNA'nın hücre popülasyonundan izole edilmesiyle, ilgi fenotipine neden olan genler, sgRNA bolluğunun yeni nesil dizilem...

CRISPR-Cas, kümelenmiş düzenli olarak aralıklı kısa palindromik tekrarlar ve CRISPR ilişkili nükleaz ın kısaltması, sentetik bir kılavuz RNA (sgRNA) ile kompleks halinde tek bir nükleaz proteininden (örn. Cas9) oluşur. Bu ribonükleoprotein kompleksi Cas9 enzimini hedef alarak belirli bir genomik lokus1'deçift iplikçikli DNA kırıklarına neden olur. Çift iplikli molalar homoloji yönelimli onarım (HDR) veya daha yaygın olarak, homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) yoluyla onarılabilir, sık sık gen fonksiyonunu bozan ekleme ve/veya silme (INDELS) ile sonuçlanan hataya açık bir onarım mekanizması 1. CRISPR'ın etkinliği ve basitliği, önceki genom düzenleme teknolojilerini (örneğin, çinko parmak çekirdekleri (ZNF) veya transkripsiyon aktivatör benzeri efektör çekirdekleri aşan daha önce ulaşılmaz bir genomik hedefleme düzeyisağlar ( TALENS), her ikisi de artan tasarım karmaşıklığı muzdarip, düşük transfection verimliliği, ve multipleks gen düzenleme sınırlamaları2].
CRISPR tek kılavuzLu RNA tabanlı genom düzenleme temel araştırma uygulaması bilim adamları verimli ve ucuza bireysel genlerin işlevlerini ve genetik etkileşim ağlarının topoloji sorgulamak için izin verdi. Özellikle RNA paraziti (RNAi) ve gen kapanı mutagenezi gibi daha önceki genetik pertürbasyon teknolojileri ile karşılaştırıldığında, crispr-Cas sisteminin kullanımı yla fonksiyonel genom çapındaki ekranlar gerçekleştirebilme yeteneği büyük ölçüde artırılmıştır. Özellikle, RNAi yüksek off-hedef etkileri ve eksik nakavt muzdarip, CRISPR göre daha düşük duyarlılık ve özgüllük sonuçlanan3,4,5, gen tuzak yöntemleri haploid sadece uygulanabilir iken fonksiyon kaybı ekranlar için hücreler, sorgulanabilir hücre modellerinin kapsamını sınırlayan6. CRISPR'ın tam gen nakavtı üretme yeteneği, mutant fenotipleri sorgulamak için daha biyolojik olarak sağlam bir sistem sağlar, düşük gürültü, minimum hedef dışı etkiler ve reaktifler arasında tutarlı aktivite5. Tüm insan genomunu hedefleyen CRISPR-Cas9 sgRNA kütüphaneleri artık yaygın olarak mevcuttur, tek bir deneyde binlerce gen nakavtının aynı anda üretilmesine izinverir 3,7,8,9 .
Toronto Knock-out (TKO) kütüphaneleri (Addgene aracılığıyla temin edilebilir) adı verilen ve yüksek çözünürlüklü genomik ekranları kolaylaştırmak için kompakt ve dizi optimize edilmiş benzersiz CRISPR-Cas9 genom çapındaki sgRNA lentiviral kütüphaneler geliştirdik. En son kütüphane, TKOv3, hedef ~ 18,000 insan protein kodlama genleri ile 71.090 kılavuzları ampirik veri10kullanarak düzenleme verimliliği için optimize edilmiştir. Buna ek olarak, TKOv3 tek bileşenli bir kütüphane olarak kullanılabilir (LCV2::TKOv3, Addgene ID #90294) tek bir vektör üzerinde Cas9 ve sgRNA'ları ifade ederek, geniş bir yelpazede genom çapında nakavt sağlayan, kararlı Cas9 ifade eden hücreler üretme ihtiyacını hafifleterek memeli hücre tipleri. TKOv3 cas9 olmadan bir vektör de mevcuttur (pLCKO2::TKOv3, Addgene ID # 125517) ve Cas911ifade hücrelerde kullanılabilir.
Genom çapında crispr-Cas9 düzenlenmiş hücre popülasyonu farklı büyüme koşullarına maruz kalabilir, zaman içinde sgRNA bolluğu yeni nesil sıralama ile ölçülür, izlenebilir genetik hücrelerin terk veya zenginleşmesi değerlendirmek için bir okuma sağlayan tedirginlikler. CRISPR nakavt kütüphaneleri, tedirginlik üzerine hücresel fitness bozukluklarına, orta derecede ilaç duyarlılığına (örneğin, hassas veya dirençli genler) neden olan, protein ekspresyonunu (örn. muhabir) düzenleyen veya belirli bir yol fonksiyonu ve hücresel durum12,13,14. Örneğin, bir kanser hücresi hattında diferansiyel fitness ekranları hem tükenmesi veya onkogenlerin azaltılması ve zenginleştirme veya tümör bastırıcıgenler genlerin bir artış tespit edebilirsiniz3,14,15. Benzer şekilde, terapötik ilaçların ara dozlarda kullanarak hem ilaç direnci ve duyarlılık genleri ortaya çıkarabilir16,17.
Burada verilen genom ölçekli CRISPR-Cas9 fonksiyon kaybı tarama için ayrıntılı bir tarama protokolü Toronto Knock-out kütüphaneleri kullanarak (TKOv1 veya v3) kütüphane nesil memeli hücrelerde, veri analizi için tarama performansı. Bu protokol Toronto Knock-out kitaplıkları kullanılarak tarama için optimize edilmiş olsa da, uygulanabilir ve tüm CRISPR sgRNA havuzlu kütüphaneler için ölçeklenebilir hale.

<table><tbody><tr><td>0.22 mikron filtre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 derece; C plaka inkübatörü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 & derece; C çalkalama inkübatörü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&deg; C, %5 CO2 inkübatörü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Promega</td><td>V4221</td><td></td></tr><tr><td>50X TAE tamponu</td><td>BioShop</td><td>TAE222.4</td><td></td></tr><tr><td>6 N Hidroklorik asit çözeltisi</td><td>BioShop</td><td>HCL666.500</td><td></td></tr><tr><td>%95 Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alamar mavisi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>DAL1025</td><td></td></tr><tr><td>Mavi ışık transilluminatörü</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini, Isı Şoku İzolasyonu, Fraksiyon V. Min. %98, Biyoteknoloji sınıfı</td><td>Bioshop</td><td>ALB001.250</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Eagles Orta Yaşam Teknolojilerinin Modifikasyonu</td><td></td><td>11995-065</td><td>Cel kültür ortamı</td></tr><tr><td>Elektroporasyon küvetleri</td><td>BTX</td><td>45-0134</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporatör</td><td>BTX</td><td>45-0651</td><td></td></tr><tr><td>Endura elektroyetkin hücreler</td><td>Lucigen</td><td>90293</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>GIBCO</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T paketleme hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>tavsiye edilen geçiş numarası < 15</td></tr><tr><td>Heksadimetrin Bromür (Polibren)</td> <td>Sigma</td><td>H9268</td><td>İletim verimliliğini artırmak için katyonik polimer</td></tr><tr><td>Heksadimetrin Bromür (Polibren)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karbenisilinli</td><td></td><td></td><td></td>LB agar plakaları</tr><tr><td>Karbenisilinli</td><td></td><td></td><td></td>LB ortamı</tr><tr><td>Düşük moleküler ağırlıklı DNA merdiveni</td><td>New England Biolabs</td><td>N3233S</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop spektrofotometre</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Q5 Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0544L</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>İndirgenmiş serum ortamı</td></tr><tr><td>Plazmid maksi saflaştırma kiti</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G (zarf plazmidi)</td><td>Addgene</td><td>Plazmid #12259</td><td>lentiviral sistem</td></tr><tr><td>psPAX2 (paketleme plazmidi)</td><td>Addgene</td><td>Plazmid #12260</td><td>lentiviral sistem</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Wisent</td><td>400-160-UG</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick jel ekstraksiyon kiti</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR testi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32853</td><td></td></tr><tr><td>Qubit florometre</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Invitrogen</td><td>12091021</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C geri kazanım ortamı</td><td>Invitrogen</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>SYRB Güvenli DNA jel lekesi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Toronto KnockOut CRIPSR kitaplığı (TKOv3) - Cas9 dahil</td><td>Addgene</td><td>Addgene ID # 90203</td><td>Genom çapında CRISPR kütüphanesi, Cas9, 71,090 sgRNA içerir</td></tr><tr><td>Toronto KnockOut CRIPSR kütüphanesi (TKOv3) - cas9 olmayan</td><td>Addgene</td><td>Addgene ID #125517</td><td>Genom çapında CRISPR kütüphanesi, Cas9 olmayan, 71.090 sgRNA</td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE) çözeltisi, pH8.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure agaroz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Wizard genomik DNA saflaştırma kiti</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 DNA transfeksiyon reaktifi</td><td>Roche</td><td>06 365 809 001</td><td>Lipid bazlı transfeksiyon reaktifi</td></tr></tbody></table>

memeli hücrelerinde havuzlu crispr tabanlı genetik ekranlar

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

CRISPR-Cas sistemini kullanarak genom düzenleme, çeşitli organizmaların genomlarını tam olarak düzenleme yeteneğini büyük ölçüde ilerletmiştir. Memeli hücreleri bağlamında, bu teknoloji fonksiyonel genomik çalışmalar için genom çapında genetik ekranlar gerçekleştirmek için yeni bir araç temsil eder. Tüm açık okuma çerçevelerini hedefleyen kılavuz RNA'ların (sgRNA) kütüphaneleri, gen fonksiyonunu ve hücresel süreçleri bir tarafsız ve sistematik bir şekilde. CRISPR-Cas ekranlar, araştırmacılara hücresel fenotiplerin genetik planlarını ortaya çıkarmak için basit, verimli ve ucuz bir yöntem sunar. Ayrıca, çeşitli hücre hatları ve farklı kanser türlerinde gerçekleştirilen ekranların diferansiyel analizi tümör hücrelerinde bağlamsal olarak gerekli olan genleri belirleyebilir, belirli antikanser tedavileri için potansiyel hedefleri ortaya koymaktadır. İnsan hücrelerinde genom genişliğinde ekranlar yapmak göz korkutucu olabilir, çünkü bu on milyonlarca hücrenin işlenmesini gerektirir ve büyük veri kümelerinin analizini gerektirir. Hücre satırı karakterizasyonu, CRISPR kitaplık konuları ve analiz sırasında CRISPR teknolojisinin sınırlamalarını ve yeteneklerini anlama gibi bu ekranların ayrıntıları genellikle göz ardı edilir. Burada havuzlu genom çapında CRISPR-Cas9 tabanlı ekranların başarılı performans için ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır.

Genom ölçeğinde CRISPR tarama iş akışına genel bakış
Şekil 1, tek entegrasyon olayları ve yeterli kütüphane gösterimi (genellikle 200- 1000) sağlamak için düşük bir MOI CRISPR kütüphane lentivirus ile hedef hücrelerin enfeksiyonu ile başlayan, havuzlu CRISPR tarama iş akışı genel bir bakış göstermektedir -katlayın). Enfeksiyon dan sonra, hücreler transduced hücreler için seçmek için...

CRISPR-Cas9 teknolojisi, memeli lerin genomunu herhangi bir hücre tipinde tam olarak dizmek için etkili bir yöntem sağlar ve genom çapında genetik ekranlar gerçekleştirmek için yeni bir araç tır. Havuzlu genom genişliğindeCRISPR-Cas9 ekranlarının başarılı bir şekilde performans alabildikleri adımları tartışan ayrıntılı bir protokol burada verilmiştir.

Memeli Hücrelerinde Havuzlu CRISPR Tabanlı Genetik Ekranlar

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

CRISPR ekranlı açılır ekranlar, araştırmacılara genom genelindeki zincir fonksiyonunu sorgulamak için basit, verimli ve ucuz bir yöntem sunar. CRISPR'ın avantajı, kılavuz dizisini değiştirerek herhangi bir geni düzenleme becerisidir. CRISPR rehber kütüphaneleri, araştırmacıların bir deneyde herhangi bir organizmanın tüm genomunu tarafsız ve sistematik bir şekilde sorgulamalarına olanak tanır.Şu anda, CRISPR ekranlar insan kanserleri yüzlerce arasında temel genleri belirlemek ve genetik etkileşimleri haritalamak için kullanılmaktadır. Ekranlar da kapsamlı eylem uyuşturucu mekanizmaları ortaya çıkarmak için ilaçların profilini çıkarabilirsiniz. Burada açıklanan CRISPR kütüphaneleri insan hücrelerini hedef almaktadır.Ancak, fare gibi diğer türleri hedefleyen kılavuz kitaplıklar kullanılabilir ve benzer şekilde taranabilir. İnsan hücrelerinde genom genişliğinde ekranlar yapmak, on milyonlarca hücrenin işlenmesini gerektirdiği ve büyük veri kümelerinin analizini gerektirdiği için pratikte yıldırıcı olabilir. Bir ekrana başlamadan önce, hücre çizgilerinin dikkatle karakterize edildiklerinin sağlanmasını sağlayın.Bu hücre hattının saflığını bilmek içerir, iki katına zaman, lentivirus transdüksiyon verimliliği, ve antibiyotik seçimi ajanları için duyarlılıkları. Görsel bir gösteri, bir ekranda gereken milyonlarca hücreyi pratik olarak nasıl işleyeceğiniz ve binlerce tedirginliğin sistematik bir şekilde nasıl izleyeceğinin bir resmini sağlayacaktır. Prosedürü gösteren Andrea Habsid, Kamaldeep Aulakh ve Ryan Climie, benim laboratuvar tüm teknisyenler olacaktır.Hazır CRISPR sgRNA plazmidini elektroyit hücrelere dönüştürerek ve el yazması talimatlara göre büyüterek başlayın. Kolonileri hasat hazır olduğunda, her plaka carbenicillin ile LB yedi mililitre ekleyin ve hücre yayıcı ile kolonileri kazıyın. Kazınmış hücreleri steril bir litrelik konik şişeye aktarmak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın ve plakayı beş mililitre LIK LB ile karbenicillin ile durulayın.Yine, şişeye durulama çözeltisi aktarın. Hücreleri el yazması yönlere göre santrifüj edin ve sonra ıslak peletin ağırlığını belirleyin. Plazmid DNA'sını Maxi veya Mega ölçekli plazmid arınma kiti kullanarak arındırın.293 T-hücresi tohumlayarak ve bir gecede kuluçkaya yatarak hücreleri transfeksiyoniçin hazırlayın. Ertesi gün, 15 santimetreplakalar için üç transfection plazmid karışımı nı hazırlayın. Bir transfeksiyon için gerekli plazmid miktarını hesaplayın ve plaka sayısı için plazmidkarışımı yapmak, artı bir, transfected için.Daha sonra, her transfeksiyon için bir lipid bazlı transfeksiyon reaktifi ve aliquot azaltılmış serum media için tek tek 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplere transfected plaka sayısı için hazırlayın. Transfeksiyon reaktifini ekleyin, hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra transfeksiyon reaktifine DNA kompleksinin mikrogramlarına 3-1 oranında DNA ekleyin.Çözeltiyi hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika bekletin. Transfeksiyon karışımını ambalaj hücrelerine ekleyin ve el yazması talimatlara göre kuluçkaya yatırın. Viral hasat gününde, iyi bir virüs üretiminin bir göstergesi olarak anormal ve erimiş morfoloji için hücreleri kontrol edin ve supernatant toplayıp steril bir santrifüj tüpüne aktararak lentivirus hasat.Ekran boyunca muhafaza edilecek CRISPR kılavuzu RNA kitaplık kapsamını seçerek başlayın. Kitaplık kapsamına bağlı olarak, kılavuz RNA başına korumak için gereken hücre sayısını ve MOI 0.3'te enfeksiyon için gereken hücre sayısını belirleyin. Daha sonra, enfeksiyonu kurmak için gerekli plaka sayısını belirleyin ve sonra, hasat ve her plaka hücreleri tohum.Tüm plakalara hexadimethrine bromür ekleyin ve tarama ve kontrol iki plaka için virüs gerekli hacmi ekleyin. Kontrol etmek için virüs eklemeyin. Bu ses düzeyini medyayla değiştirin.Plakaları yatırarak iyice karıştırın ve plakaları bir kuvöze yerleştirin ve düz olduğundan emin olun. El yazması talimatlara göre enfekte hücreleri hasat ve genomik DNA çıkarma için havuzlu hücrelerden hücre peletlerinin üç kopya toplamak. Hücreleri 500 kez g'de beş dakika santrifüj edin ve PBS ile yıkayın.Tüpleri etiketle ve hücre peletlerini eksi 80 derecede kurutun. Virüslü hücre havuzunu üç çoğaltma grubuna bölün ve her çoğaltma içinde kitaplık kapsamını koruduğundan emin olun. Hücreleri genişletirken normalde kullanılacak bir yoğunlukta tohumlayın.Her çoğaltma için aynı sayıda hücre ve çoğaltmalar arasında aynı toplam hücre sayısını kullanın. Hücreleri geçiş ve 15 ila 20 hücre iki katına kadar havuzlu enfekte hücrelerin her çoğaltma hücre pelet üç çoğaltma hasat devam edin. Her geçitte, her bir tabaktaki hücreleri birbiriyle çoğaltın.Her peleti zamana göre etiketlendirin ve atamayı çoğaltın. 50 mikrolitrelik reaksiyon başına 3,5 mikrogram genomik DNA'da toplam 100 mikrogram genomik DNA ile el yazması talimatlara göre PCR1'i kurun ve istenilen kapsama alanını elde etmek için aynı 50 mikrolitrelik reaksiyonları ayarlayın. El yazması talimatlara göre bir PCR tüp reaksiyonu ayarlayın.Bir şablon olarak havuza alınan PCR1 ürününün beş mikrolitresini kullanın ve sıralama kitaplığı örneklerinin biraraya getirmek için her bir örnek için benzersiz dizin astar kombinasyonları kullanın. PCR'yi tamamladıktan sonra, PCR tüp ürününü 1 ila 1/2 saat düşük voltajda %2 agarose jel üzerinde çalıştırın. Ürünü mavi ışık transilluminator üzerinde görselleştirin ve 200 baz çifti bandını çıkarın.DNA'yı arındırın ve hem spektrofotometre hem de florometre ile miktarını ve kalitesini ölçün. İdeal bir kılavuz RNA kitaplığı her bir kılavuz RNA benzer miktarlarda temsil olmalıdır. Yeni nesil sıralama, kitaplığın kılavuz RNA'larının sıkı bir dağılımına sahip olduğunu doğrulamak için kullanılabilir.Hassas hatırlama çözümlemesi ekran performansını değerlendirmek için kullanılabilir. Yüksek performanslı bir ekran, altıdan daha büyük bir baz faktöründe çok sayıda temel geni kurtarmalı ve %5'ten daha az bir yanlış keşif hızı hassas geri çağırma eğrisi keskin bir dirseğe ve terminal noktasına doğru düz bir çizgiye sahip olmalıdır. Bayes faktörü gen nakavt bir fitness kusuru sonuçları bir güven ölçüsü temsil eder.Yüksek skorlar güvenin arttığını gösterirken, düşük puanlar gen nakavtın büyüme avantajları sağladığını göstermektedir. Genom çapında nakavt havuzları bastırıcı direnç genleri aramak için aşırı ilaç ajan varlığında kültürlü olabilir. Timidin bloğunun bastırıcısı için pozitif bir seçim ekranı gerçekleştirmek için, T0'daki tüm kılavuz RNA'lar için normalleştirilmiş okuma sayıları, timidin ile tedavi edilen numuneler için ortalama normalleştirilmiş okuma sayılarına göre çizilir.CRISPR ekranlarının başarılı bir şekilde performans göstermesinin önemli bir ayrıntısı, plazmidin transdüksiyonundan hücrelerin transdüksiyonuna kadar her kılavuz RNA'nın iyi dağılımını sağlamaktır. Bu kılavuz RNA gösterimi çarpık ve yanlış pozitif veya olumsuz sonuçlara yol açabilir rasgele etkileri olasılığını en aza indirecektir. Bir ekran doğrulamasını takiben, birincil ekran yalnızca olası isabetleri tanımladığından, isabetleri doğrulamak için denemeler yapılmalıdır.Vuruşların biyolojisi bağlı olarak çeşitli yöntemler kullanılabilir. CRISPR düzenleme, yeni nesil sıralama ile birlikte, çeşitli insan modeli sistemlerinde fonksiyon ekranlarının genom ölçeğinde kaybına olanak sağlamıştır. CRISPR basitliği nedeniyle, ekranlar bu tür artık geniş tüm araştırmacılar için erişilebilir, daha fazla bilim adamı biyolojik süreçler ve hastalık çalışma için fonksiyonel genetik yöntemler kullanmak için izin.

pooled-crispr-based-genetic-screens-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Genetics

Burada hücre sağkalım teşvik gen hedefleri belirlemek için sıralama yöntemlerini bir insan LentiPlex toplanmış kütüphane ve geleneksel kullanın. Biz kurmak ve deconvolute bir LentiPlex ekran ve sonuçları doğrulamak nasıl göstermektedir.

MİSYON LentiPlex Memeli Hücreleri shRNA Kütüphane Tarama Pooled

CRISPR/Cas9, genlerin ve genetik elementlerin bozulmasını sağlayan sağlam bir sistemdir. Burada, CRISPR / Cas9 kullanarak memeli hücre hatlarında genomik delesyonların verimli bir şekilde oluşturulması için bir protokol açıklıyoruz.

CRISPR / Cas9 üzerinden Memeli Hücre Hatlarında Genomik Delesyonlar Üretimi

Somatik hücre dizilerini genetik olarak manipüle etme becerisindeki son gelişmeler, temel ve uygulamalı araştırmalar için büyük potansiyele sahiptir. Burada, CRISPR / Cas9'un ürettiği nakavt üretimi ve seçilebilir işaretlerin kullanılıp kullanılmadığı memeli hücre hatlarında tarama için iki yaklaşım sunuyoruz.

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout&#39;larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

Biz bir küçük saç tokası RNA (shRNA) ve düzenleyiciler, x kromozomu inactivation ateş böceği luciferase ile bir fare hücre satırı tanımlamak için sonraki nesil sıralama tabanlı iletişim kuralı raporu ve hygromycin direnç genleri metil için erimiş CpG bağlayıcı protein 2) MeCP2) etkin olmayan X kromozomu üzerindeki gen.

Havuza alınan shRNA MeCP2 reaktivasyonu üzerinde etkin olmayan X kromozomu için ekran

Burada bir iletişim kuralı açıklamak yüksek üretilen iş RNAi tarama oncolytic virüs tedavisi geliştirmek için manipüle edilebilir ana hedefleri ortaya çıkarmak için istihdam için özellikle rhabodvirus ve vaksinia virüs tedavisi, ama -ebilmek var olmak diğer oncolytic için kolayca adapte virüs platformlar veya virüs çoğaltma genellikle modüle ana bilgisayar genler keşfetmek için.

Tedavi Oncolytic virusu modüle ana faktörleri tanımlamak için genom çapında RNAi tarama

Bu el yazması, hücre dışı reseptör-ligand etkileşimlerini tanımlamak için genom ölçeğinde hücre tabanlı tarama yaklaşımını açıklamaktadır.

Genom ÖlçeğiCRISPR/Cas9 Genetik Ekranlar Kullanılarak Hücre Yüzey Reseptör Tanımlama

Burada, immün yetmetik farelerin deri ve ağız boşluğundaki çeşitli genlerin işlevlerini aynı anda değerlendirmek için utero embriyonik lentiviral enjeksiyonlarda ultrason güdümlü ultrason güdümlü kullanarak hızlı ve doğrudan bir in vivo CRISPR / Cas9 tarama metodolojisini açıklıyoruz.

Fare Derisi ve Ağız Boşluğundaki Gen İşlevlerini Aynı Anda Değerlendirmek için Vivo CRISPR/Cas9 Taraması

Bir lentiviral shRNA havuzu kullanılarak yüksek verimli RNA girişimi (RNAi) taraması, malignitelerde terapötik olarak ilgili sentetik ölümcül hedefleri tespit etmek için bir araç olabilir. Akut miyeloid lösemide (AML) epigenetik efektörleri araştırmak için havuzlanmış bir shRNA tarama yaklaşımı sunuyoruz.

Bir İlaç Direnci Fenotipini Modüle Eden Faktörleri Tanımlamak için Havuzlanmış shRNA Kütüphanesi Taraması

Genom çapında bir CRISPR / Cas9 tarama yönteminin uygulanması yoluyla dirençli ve hassas radyasyon genlerini seçmek için titiz ve yapılandırılmış bir yaklaşım verilmiştir. Bu protokol aynı zamanda klinik olarak uygulanan kimyasal ilaçlara direnç mekanizmalarını araştıran diğer araştırma çabaları için çok yönlü bir çerçeve olarak hizmet etme potansiyeline sahiptir.

Radyosensitif ve radyodirençli genleri ortaya çıkarmak için genom çapında CRISPR ekranı

Bu protokol, fare meme bezinde paralel in vivo gen nakavt ve aktivasyon çalışmalarını mümkün kılan ölçeklenebilir bir intraduktal CRISPR tarama yaklaşımını tanımlar.

Fare Meme Bezinde Gen Nakavt ve Aktivasyonun Paraleli In Vivo Taraması

Keşfedin havuzlu CRISPR-Cas9 genetik ekranlarını memeli hücrelerinde fonksiyonel genomik çalışmalar için. Bu yöntem, genom çapında gen fonksiyonlarını sistematik olarak inceleyerek bağlama özgü temel genleri belirlemenizi sağlar.

Memeli Hücrelerinde Havuzlu CRISPR Tabanlı Genetik Ekranlar

Daha fazla video keşfet