Name: CRISPR-Cas12a ile Kombine Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyonu Kullanılarak Sahada Konuşlandırılabilir Candidatus Liberibacter asiaticus Tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T12:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Öğrenin, sitrus bitkilerinde Huanglongbing hastalığına neden olan Candidatus Liberibacter asiaticus'un saha koşullarında hızlı ve hassas tespiti için CRISPR-Cas12a ile kombine rekombinaz polimeraz amplifikasyonu yöntemini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2021YFD1400805), Jiangxi Eyaleti Büyük Bilim ve Teknoloji Ar-Ge Programı (20194ABC28007), Jiangxi Eğitim Departmanı Projeleri (GJJ201449) ve Jiangxi Eyaletindeki Modern Tarımsal Bilimsel Araştırmaların İşbirlikçi İnovasyonu (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003) tarafından finansal olarak desteklenmiştir.

1. CLas-DETECTR'ın yapımı
NOT: CLas-DETECTR'ın yapımı dört adımlı bir işlemdir: çözelti hazırlama, narenciye toplam DNA izolasyonu, izotermal DNA amplifikasyonu ve sonuç görselleştirme. CLas-DETECTR testinin şeması Şekil 1A'da gösterilmiştir.
<ol><li>Çözelti hazırlama<ol><li>Arabellek A'yı hazırlayın: %6 PEG 200'de 20 mM NaOH. 100 mL için, bir şişede 80 mL H2 O içine 113 mg NaOH ve 6 g PEG200ekleyin. Tüm PEG 200 çözülene kadar şişeyi 60 ° C'de bir su banyosunda inkübe edin. Ardından, 100 mL'lik bir hacme H2O ekleyin.</li>
		<li>B çözeltisini hazırlayın: Her reaksiyon için, 15,5 μL'lik son hacme 10 μL RPA tamponu, 0,8 μL F-RPA-RNRf, 0,8 μL R-RPA-RNRr ve 3,9 μL ddH2O ekleyin. NOT: F-RPA-RNRf ve R-RPA-RNRr, nrdB genine karşı tahlilde kullanılan primerlerdir. Dizi için Tablo 1'e bakın.</li>
		<li>C çözeltisini hazırlayın: Her reaksiyon için, 20 μL'lik son hacme 1 μL ssDNA raporlayıcı, 3 μL NEB tamponu 3.1, 1 μL crRNA, 4 μLCas12ave 11 μL ddH 2 O ekleyin. NOT: Algılanacak çok sayıda örnek varsa, büyük miktarda B ve C çözeltisi yapın ve daha sonra aliquot yapın.</li>
	</ol></li>
	<li>Narenciye toplam DNA izolasyonu NOT: Zamandan tasarruf etmek ve bu yöntemi alan CLas tespitine uygun hale getirmek için, DNA amplifikasyonu için ham bitki özleri elde etmek üzere alkali polietilen glikol (PEG) tabanlı yaklaşım kullanılmıştır22,23<ol><li>Bu protokolde narenciye yaprakları kullanılmıştır. İlk olarak, bir yapraktan beş yaprak diski delin. Ardından, yaprak disklerini 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne koyun ve 200 μL tampon A ekleyin. NOT: Tarlada, yaprakları kaplayan toz varsa önce yaprakları temizleyin. Yaprak diskler, çapraz kontaminasyonu önlemek için 1,5 mL tüpün kapağı kullanılarak kırpılabilir. Kökler, saplar, meyveler ve çiçekler gibi diğer narenciye dokuları da bu protokolde kullanılabilir.</li>
		<li>Yaprak diskleri plastik bir çubukla pürüzsüz olana kadar manuel olarak öğütün.</li>
		<li>Tüpü 10 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın. Ardından, DNA amplifikasyonu için süpernatantı kullanın. NOT: Tahlil burada duraklatılabilir ve alkali-PEG yöntemiyle ekstrakte edilen ham bitki ekstraktları en az 1 yıl boyunca -20 ° C'de saklanabilir. Videoda gösterilen Newhall tatlı portakal (Citrus sinensis Osbeck var. Newhall) ağaçları, 9/3/1 (v / v / v) turba toprağı / vermikülit / perlit karışımı ile doldurulmuş bir tencerede yetiştirildi ve Gannan Normal Üniversitesi, Jiangxi, Çin kampüsünde bulunan bir serada muhafaza edildi. HLB ile enfekte olmuş ağaçlar, CLas pozitif Newhall tomurcukları ile aşılama ile aşılandı. HLB-enfekte ve HLB-enfekte olmamış ağaçlar PCR ile doğrulandı. CLas, CLas'a özgü belirteç geni nrdB'yi hedefleyen primer çifti (F-RPA-RNRf/R-RPA-RNRr) kullanılarak tespit edildi. Öte yandan, karakteristik HLB semptomları, lekeli benek ve sararmış yapraklar CLas pozitif ağaçlarda bulunabilir, ancak CLas negatif ağaçlarda bulunamaz.</li>
	</ol></li>
	<li>İzotermal DNA amplifikasyonu<ol><li>Adım 1.2.3'ten 1 μL süpernatantın 1 μL'sini ve 1 μL MgOAc'yi (14 mM nihai konsantrasyon) B çözeltisine ekleyin ve iyice karıştırın.</li>
		<li>Laboratuvarda, 15 dakika boyunca 37 ° C'de basit bir inkübatörde inkübe edin. NOT: Sahada, tüpleri 15 dakika boyunca elinizde tutun. Ayrıca, koşullar izin veriyorsa, tüplerin 37 ° C'de basit bir inkübatörde 15 dakika boyunca inkübe edilmesi önerilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Sonuç görselleştirme<ol><li>Karışımın 1.3.2 adımından C çözeltisine 10 μL ekleyin ve iyice karıştırın.</li>
		<li>Onları 60 dakika boyunca 37 ° C'lik bir inkübatörde inkübe edin.</li>
		<li>Gözlük takın ve 5' 6-Floresein ile etiketlenmiş ssDNA muhabirinden 5' ve floresan söndürücü 3' ile etiketlenmiş yeşil floresan sinyalini bir el tipi floresan algılama cihazı aracılığıyla gözlemleyin (uyarma dalga boyu: 440 nm, emisyon dalga boyu: 500 nm). NOT: yeşil floresan sinyali birkaç gün sürebilir, daha iyidir DİKKAT: Floresan algılama cihazı tarafından yayılan ışık gözlere zararlıdır. Sonuçları gözlemlemeden önce gözlük taktığınızdan emin olun.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Özgüllük testi
NOT: CLas-DETECTR'ın özgüllüğünü test etmek için, lizosfer bakterisi Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) ve laboratuvar 24'te izole edilen Burkholderia stabilis suşu 1440 CLas-DETECTR testine tabi tutulmuştur.
NOT: Candidatus Liberibacter (CLas) kültürlenemez. CLas DNA'sı sadece CLas ile enfekte olmuş narenciye dokularından genomik DNA'nın ekstraksiyonundan elde edilebilir. Xcc , bir başka önemli narenciye hastalığı olan narenciye konservesinin nedensel ajanıdır. Burkholderia stabilis suşu 1440, laboratuvarda izole edilmiş bir anti-Xcc bakterisidir. Bu nedenle, bu üç bakteri için saf suşlar kullanılmıştır.
<ol><li>Üreticinin protokolünü izleyerek bakteriyel genomik DNA ekstraksiyon kiti kullanarak bakteriyel genomik DNA'yı (gDNA) çıkarın. Suyu negatif kontrol olarak kullanın.</li>
	<li>1 μL F-RPA-RNRf, 1 μL R-RPA-RNRr, 12,5 μL Ex Taq Sürüm 2.0 artı boya, 1 μL DNA şablonu ve 9,5 μL H2 O içeren 25 μL reaksiyon karışımında optik kapaklı0,2mL PCR tüp şeritleri kullanarak PCR gerçekleştirin.<ol><li>Aşağıdaki termal döngü reaksiyon koşullarını kullanın: 98 °C'de 1 dakika; bunu 98 °C'de 10 sn, 55 °C'de 30 sn, 72 °C'de 15 sn'lik 35 döngü izledi; daha sonra 72 ° C'de 10 dakika; ve 16 ° C'de tutun.</li>
		<li>PCR ürünlerini 15 dakika boyunca 120 V'ta %1 agaroz jel üzerinde çalıştırın.</li>
	</ol></li>
	<li>0,8 μL F-RPA-RNRf, 0,8 μL R-RPA-RNRr, 10 μL 2x TB Yeşil Premiks Ex Taq II (Tli RNaseH Plus), DNA şablonunun 1 μL ve 7,4 μLH2 O içeren 20μL reaksiyon karışımında qPCR gerçekleştirin.<ol><li>Aşağıdaki termal döngü reaksiyon koşullarını kullanın: 95 °C'de 30 sn; bunu 95 °C'de 5 sn ve 60 °C'de 32 s'lik 45 döngü izledi; ve daha sonra 95 ° C'de 15 s, 60 ° C'de 1 dakika ve 95 ° C'de 15 s'lik bir erime eğrisi aşaması.</li>
		<li>Her tekrara üç teknik tekrar ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>1.1–1.4 arasındaki adımları izleyerek CLas-DETECTR yöntemini gerçekleştirin.</li>
</ol>3. Hassasiyet karşılaştırması
<ol><li>CLas DETECTR'ın duyarlılığını test etmek için, yukarıda açıklandığı gibi PCR, CLas-DETECTR ve qPCR kullanarak bir dizi CLas DNA parçası seyreltmesini tespit edin.</li>
	<li>4 μL F-RNR, 4 μL R-RNR, 50 μL PrimeSTAR Max Premiks, 2 μL DNA şablonu ve 40 μLH2O içeren 100 μL reaksiyon karışımında F-RNR ve R-RNR primer setini kullanarak nrdB'den 1.060 bp uzunluğunda bir DNA segmentini yükseltin (98 ° C'de 30 s; ardından 98 ° C'de 35 s'lik 10 sn döngü, ardından 98 ° C'de 35 döngü, 55 °C'de 15 sn, 72 °C'de 30 sn; daha sonra 72 ° C'de 10 dakika; ve 16 ° C'de tutun). NOT: nrdB (ribonükleotid redüktaz β- alt birim) geni CLas21'e özgüdür. NrdB amplikonu, F-RNR ve R-RNR primer setini kullanarak CLas-pozitif narenciye gDNA'sından kolayca elde edilebilir. Astar seti F-RNR ve R-RNR, 1.060 bp nrdB fragmanını yükseltirken, primer set F-RPA-RNR ve R-RPA-RNR, 1.060 bp nrdB fragmanının bir parçası olan nrdB geninin 104 bp'lik bir parçasını güçlendirir.</li>
	<li>PCR ürünlerini, üreticinin kılavuzunu izleyerek bir DNA jel ekstraksiyon kiti ile saflaştırın.</li>
	<li>NrdB amplikonlarını içeren PCR ürünlerini sterilize ddH2O ile seyreltin.</li>
	<li>Ticari olarak temin edilebilen çevrimiçi DNA kopya numarasını ve seyreltme hesaplayıcısını kullanarak nrdB geninin kopya numarasını hesaplayın.</li>
	<li>2.01 × 106 kopya/μL, 2.01 × 105 kopya/μL, 2.01 × 104 kopya/μL, 2.01 × 103 kopya/μL, 2.01 × 10 2 kopya/μL,2.01 × 101 kopya/μL, 2.01 × 100 kopya/μL ve 2.01 × 10−1 kopya/μL CLas DNA fragmanı içeren DNA seyreltmeleri hazırlayın.</li>
</ol>4. Örnek algılama
NOT: Özgüllük ve duyarlılık testinden sonra, CLas-DETECTR yöntemi, Gannan Normal Üniversitesi, Jiangxi, Çin kampüsündeki germplazma kaynak fidanlığında yetiştirilen Newhall tatlı portakal ağaçlarından toplanan tarla yaprağı örneklerinde CLas'ın varlığını tespit etmek için kullanılmıştır. Sonuçları doğrulamak için bir qPCR gerçekleştirildi.
<ol><li>Toplam 15 ağacı test edin. Suyu negatif kontrol olarak kullanın.</li>
	<li>CLas-DETECTR ve qPCR yöntemlerini yukarıda açıklandığı gibi gerçekleştirin. NOT: CLas'ın narenciyedeki eşit olmayan dağılım özellikleri nedeniyle, HLB semptomları gösteren yapraklar öncelikli olarak toplanmıştır. Bir ağaç sağlıklı görünüyorsa, yapraklar rastgele toplandıCLas-DETECTR sistemi doğru çalışıyor.</li>
</ol>

<ol><li>Ma, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrus+Huanglongbing+is+a+pathogen-triggered+immune+disease+that+can+be+mitigated+with+antioxidants+and+gibberellin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin.</a> Nature Communications. 13 (1), 529(2022).</li>
<li>Bové, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huanglongbing%3A+A+destructive%2C+newly-emerging%2C+century-old+disease+of+citrus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus.</a> Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).</li>
<li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Candidatus+Liberibacter-host+interface%3A+Insights+into+pathogenesis+mechanisms+and+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control.</a> Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).</li>
<li>Kim, J. S., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+copy+numbers+of+16S+rDNA+and+16S+rRNA+of+Candidatus+Liberibacter+asiaticus+and+the+implication+in+detection+in+planta+using+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR.</a> BMC Research Notes. 2, 37(2009).</li>
<li>Maheshwari, Y., Selvaraj, V., Godfrey, K., Hajeri, S., Yokomi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+%26%2334%3BCandidatus+Liberibacter+asiaticus%26%2334%3B+and+Spiroplasma+citri+by+qPCR+and+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of &#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&#34; and Spiroplasma citri by qPCR and droplet digital PCR.</a> PLoS One. 16 (3), e0242392(2021).</li>
<li>Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nested-PCR+detection+and+sequence+confirmation+of+%27Candidatus+Liberibacter+asiaticus%27+from+Murraya+paniculata+in+Guandong%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">Nested-PCR detection and sequence confirmation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' from Murraya paniculata in Guandong, China.</a> Plant Disease. 91 (8), 1051(2007).</li>
<li>Ding, F., Duan, Y., Yuan, Q., Shao, J., Hartung, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serological+detection+of+%27Candidatus+Liberibacter+asiaticus%27+in+citrus%2C+and+identification+by+GeLC-MS%2FMS+of+a+chaperone+protein+responding+to+cellular+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Serological detection of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens.</a> Scientific Reports. 6, 29272(2016).</li>
<li>Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+detection+of+Candidatus+Liberibacter+asiaticus%2C+a+causal+agent+of+citrus+Huanglongbing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Pathology+Journal%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Candidatus Liberibacter asiaticus, a causal agent of citrus Huanglongbing.</a> The Plant Pathology Journal. 34 (6), 499-505 (2018).</li>
<li>Ghosh, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+recombinase+polymerase+based+isothermal+amplification+combined+with+lateral+flow+assay+%28HLB-RPA-LFA%29+for+rapid+detection+of+%26%2334%3BCandidatus+Liberibacter+asiaticus%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of a recombinase polymerase based isothermal amplification combined with lateral flow assay (HLB-RPA-LFA) for rapid detection of &#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&#34;.</a> PLoS One. 13 (12), e0208530(2018).</li>
<li>Ravindran, A., Levy, J., Pierson, E., Gross, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+procedure+as+a+sensitive+and+rapid+method+for+detection+of+%27Candidatus+Liberibacter+solanacearum%27+in+potatoes+and+psyllids%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of 'Candidatus Liberibacter solanacearum' in potatoes and psyllids.</a> Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).</li>
<li>Chertow, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+diagnostics+with+CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Next-generation diagnostics with CRISPR.</a> Science. 360 (6387), 381-382 (2018).</li>
<li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li>
<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li>
<li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+and+portable+nucleic+acid+detection+platform+with+Cas13%2C+Cas12a%2C+and+Csm6%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6.</a> Science. 360 (6387), 439-444 (2018).</li>
<li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+and+visual+detection+of+SARS-CoV-2+using+all-in-one+dual+CRISPR-Cas12a+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay.</a> Nature Communications. 11 (1), 4711(2020).</li>
<li>Qian, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+detection+of+human+metapneumovirus+using+CRISPR-Cas12a+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics.</a> Virus Research. 305, 198568(2021).</li>
<li>Marques, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostics+of+infections+produced+by+the+plant+viruses+TMV%2C+TEV%2C+and+PVX+with+CRISPR-Cas12+and+CRISPR-Cas13%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).</li>
<li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+equipment-free+method+for+detecting+Phytophthora+infestans+in+the+field+using+a+lateral+flow+strip-based+recombinase+polymerase+amplification+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay.</a> Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).</li>
<li>Lobato, I. M., O'Sullivan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinase+polymerase+amplification%3A+Basics%2C+applications+and+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances.</a> Trends in Analytical Chemistry. 98, 19-35 (2018).</li>
<li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-Cas12a-derived+biosensing+platform+for+the+highly+sensitive+detection+of+diverse+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules.</a> Nature Communications. 10 (1), 3672(2019).</li>
<li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unusual+five+copies+and+dual+forms+of+nrdB+in+%26%2334%3BCandidatus+Liberibacter+asiaticus%26%2334%3B%3A+Biological+implications+and+PCR+detection+application%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Unusual five copies and dual forms of nrdB in &#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&#34;: Biological implications and PCR detection application.</a> Scientific Reports. 6, 39020(2016).</li>
<li>Chomczynski, P., Rymaszewski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+polyethylene+glycol-based+method+for+direct+PCR+from+bacteria%2C+eukaryotic+tissue+samples%2C+and+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Alkaline polyethylene glycol-based method for direct PCR from bacteria, eukaryotic tissue samples, and whole blood.</a> BioTechniques. 40 (4), 454-458 (2006).</li>
<li>Yang, Y. G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+gene+amplification+from+Arabidopsis+leaves+using+Any+Direct+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system.</a> Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).</li>
<li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescent+reporter-based+evaluation+assay+for+antibacterial+components+against+Xanthomonas+citri+subsp.+citri%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 864963(2022).</li>
<li>Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+and+rapid+detection+of+citrus+Huanglongbing+pathogen+%28%27Candidatus+Liberibacter+asiaticus%27%29+using+Cas12a-based+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen ('Candidatus Liberibacter asiaticus') using Cas12a-based methods.</a> Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).</li>
</ol>

Yazarlar, rakip çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu çalışma, RPA ve CRISPR-Cas12a sistemlerini birleştiren CLas-DETECTR adlı CLas'ı tespit etmek için hızlı ve taşınabilir bir yöntem sunmaktadır. İş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir. CLas-DETECTR, CLas'ı özgüllük ve hassasiyetle algılar (Şekil 2 ve Şekil 3). Ayrıca, Newhall yaprak örneklerini kullanan CLas-DETECTR, CLas'ı qPCR ile aynı hassasiyetle algılar (Şekil 4). Özellikle, algılama ...

Huanglongbing (HLB), dünya çapında en sorunlu narenciye hastalıklarından biridir1. HLB, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus ve Ca. L. americanus2 dahil olmak üzere floem kolonize edici ve titiz bakteriler Candidatus Liberibacter spp.'den kaynaklanır. Çin ve ABD'de HLB ile ilişkili en yaygın tür, Asya narenciye psyllidleri (Diaphorina citri) veya aşılama yoluyla bulaşan CLas'tır3. CLas tarafından enfekte edildikten sonra, narenciye ağaçları ölüm2'ye kadar büyüme düşüşü gösterir. CLas ile enfekte olmuş narenciye yapraklarının yaygın semptomları lekeli benek, yeşil adalar (küçük dairesel koyu yeşil noktalar), daha kalın ve kösele yapraklar üzerinde yükseltilmiş mantarlı damarlar ve düzgün olmayan sararma sürgünleridir2. Ek olarak, CLas ile enfekte olmuş meyveler küçük ve orantısız görünür2.
Hiçbir narenciye çeşidi HLB'ye dirençli olmadığından ve HLB için terapötik bir tedavi olmadığından, HLB'nin önlenmesi CLas pozitif narenciye ağaçlarının karantinaya alınmasını ve izolasyonunu gerektirir 2,3. Bu nedenle, CLas'ın yayılmasını önlemek ve ekonomik kayıpları en aza indirmek için erken teşhis izleme ve karantinaya almak için kritiköneme sahiptir 3. Ek olarak, enfeksiyonun erken evresinde bitkilerde CLas'ın düşük titresi nedeniyle hassas CLas tespiti gereklidir3. Çin'de, CLas tespiti genellikle belirli sertifikalı test merkezleri tarafından gerçekleştirilir. Bununla birlikte, algılama işlemi genellikle en az 1 hafta sürer ve tespit ücreti pahalıdır. Bu nedenle, HLB insidansını izlemeye yardımcı olmak için
HLB 4,5,6,7,8,9 tanısında çeşitli teknolojiler uygulanmıştır. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve kantitatif PCR (qPCR), yüksek duyarlılıkları ve özgüllükleri nedeniyle CLas tespiti için en çok kullanılan araçlardır 4,5. Bununla birlikte, bu teknolojiler büyük ölçüde pahalı araçlara ve yüksek vasıflı personele dayanmaktadır. Ek olarak, döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) gibi çeşitli izotermal amplifikasyon yöntemleri, basitlikleri, hızları ve düşük maliyetleri nedeniyle geleneksel PCR yöntemlerine cazip alternatifler olarak geliştirilmiştir 8,9,10. Bununla birlikte, yanlış pozitif sonuçlara neden olabilecek spesifik olmayan amplifikasyon sinyalleri nedeniyle CLas'ı doğru bir şekilde tespit etmek için bunları uygulamak zordur.
RNA rehberliğinde CRISPR / Cas (düzenli olarak aralıklı kısa palindromik tekrarlar / CRISPR ile ilişkili kümelenmiş) endonükleaz bazlı nükleik asit tespiti, yüksek hassasiyeti, özgüllüğü ve güvenilirliği nedeniyle yeni nesil bir moleküler tanı teknolojisi olarak geliştirilmiştir11,12,13,14. Bu CRISPR / Cas teşhis teknolojileri, oligonükleotidlerin her iki ucunda bir floresan muhabir ve bir floresan söndürücü ile modifiye edilmiş tek sarmallı DNA'yı (ssDNA) parçalamak için Cas proteinlerinin kollateral nükleaz aktivitesine ve ayrıca serbest bırakılan floresan muhabirini yakalamak için bir floresan tespit cihazına dayanır11,12 . CRISPR RNA (crRNA) hedef dubleks tarafından aktive edilen birkaç Cas efektörünün nükleaz aktivitesi, çevredeki hedef olmayan ssDNA11'i ayrım gözetmeksizin parçalayabilir. Sınıf 2 tip V-A CRISPR/Cas sistemi olan CRISPR-Cas12a (Cpf 1 olarak da adlandırılır), Cas9 ile karşılaştırıldığında, daha düşük uyumsuzluk toleransı ve daha fazla özgüllük13 gibi çeşitli avantajlar gösterir. Cas12a/crRNA sistemi, insan patojenlerinin ve fitopatojenlerin nükleik asitlerinin hassas ve spesifik tespiti için uygulanmıştır 14,15,16,17,18. Bu nedenle, Cas12a / crRNA sisteminin kullanılması, CLas'ın nükleik asidinin doğru ve hassas bir şekilde algılanmasını sağlamalıdır.
Cas12a tek başına teorik olarak düşük nükleik asit seviyelerini tespit edecek kadar hassas değildir. Bu nedenle, algılama hassasiyetini artırmak için, CRISPR-Cas12a algılama tipik olarak bir izotermal amplifikasyon adımı14,15 ile birleştirilir. Rekombinaz polimeraz amplifikasyonu (RPA), 37 °C ila 42 °C19 sıcaklık aralığında hassas ve hızlı izotermal DNA amplifikasyonu sağlar.
Cas12a'nın DNaz aktivitesini RPA ve floresan okuması ile birleştiren DETECTR (DNA Endonükleaz Hedefli CRISPR Trans Reporter) adlı bir tespit platformu yakın zamanda12 geliştirilmiştir ve nükleik asidi daha yüksek hassasiyetle tespit ettiği gösterilmiştir20. Ayrıca, pozitif numunelerden yayılan floresan sinyali, sahadaki bir el tipi floresan algılama cihazı aracılığıyla gözlemlenebilir.
DNA'yı RPA ile güçlendirdiğimizden, CLas 21'e özgü beş kopyalı nrdB (ribonükleotid redüktaz β- alt birim) genini hedefleyen crRNA'yı tasarladığımızdan veCas12a proteininin DNaz aktivitesini kullandığımızdan, buna CLas tespit yöntemini CLas-DETECTR adını verdik. Mevcut CLas algılama yöntemleriyle karşılaştırıldığında, CLas-DETECTR hızlı, doğru, hassas ve konuşlandırılabilir.

<table><tbody><tr><td>AxyPrep DNA Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Corning</td><td>09319KE1</td><td>Çin</td></tr><tr><td>Bakteriyel Genomik DNA Ekstraksiyon Kiti</td><td>Solarbio</td><td>D1600</td><td>Çin</td></tr><tr><td>EnGen LbCas12a&nbsp;</td><td>TOLOBIO</td><td>32104-01</td><td>Çin</td></tr><tr><td>Ex Taq Sürüm 2.0 artı boya</td><td>TaKaRa</td><td>RR902A</td><td>Çin</td></tr><tr><td>El tipi floresan algılama cihazı&nbsp;</td><td>LUYOR</td><td>3415RG</td><td>Çin</td></tr><tr><td>Delgeç&nbsp;</td><td>Deli</td><td>114</td><td>Çin</td></tr><tr><td>Magnezyum asetat, MgOAc</td><td>TwistDx</td><td>TABAS03KIT</td><td>İngiltere</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>SCR</td><td>10019718</td><td>Çin</td></tr><tr><td>NEB tamponu 3.1 & nbsp;</td><td>NEB</td><td>B7203</td><td>ABD</td></tr><tr><td>PCR şerit tüpleri</td><td>LABSELECT</td><td>PST-0208-FT-C</td><td>Çin</td></tr><tr><td>PEG 200&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P3015</td><td>ABD</td></tr><tr><td>PrimeSTAR Max DNA Polimerleri</td><td>TaKaRa</td><td>R045A</td><td>Çin</td></tr><tr><td>Hızlı Yükleme Mor 1 kb Plus DNA Merdiveni&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>N0550S</td><td>ABD</td></tr><tr><td>TB Yeşil Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)</td><td>TaKaRa</td><td>RR820B</td><td>Çin</td></tr><tr><td>TwistAmp Basic</td><td>TwistDx</td><td></td><td>TABAS03KIT İngiltere</td></tr></tbody></table>

crispr-cas12a ile kombine rekombinaz polimeraz amplifikasyonu kullanılarak sahada konuşlandırılabilir candidatus liberibacter asiaticus tespiti

Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a

Candidatus Liberibacter asiaticus'un (CLas) narenciye yetiştiricileri tarafından erken tespiti, erken müdahaleyi kolaylaştırır ve hastalığın yayılmasını önler. Hızlı ve taşınabilir Huanglongbing (HLB) tanısı için rekombinaz polimeraz amplifikasyonunu ve kümelenmiş düzenli aralıklarla aralıklı kısa palindromik tekrarlar / CRISPR ile ilişkili 12a (CRISPR-Cas12a) sisteminin nükleaz aktivitesini kullanan bir floresan muhabiri birleştiren basit bir yöntem sunulmaktadır. Bu tekniğin duyarlılığı PCR'den çok daha yüksektir. Ayrıca, bu yöntem yaprak örnekleri kullanıldığında qPCR'ye benzer sonuçlar göstermiştir. Geleneksel CLas algılama yöntemleriyle karşılaştırıldığında, burada sunulan algılama yöntemi 90 dakikada tamamlanabilir ve PCR makinelerinin kullanılmasını gerektirmeyen izotermal bir durumda çalışır. Ek olarak, sonuçlar sahadaki bir el tipi floresan algılama cihazı aracılığıyla görselleştirilebilir.

Burada, sahada HLB'yi teşhis etmek için RPA ve CRISPR-Cas12a sistemlerini tarayan taşınabilir bir platform olan CLas-DETECTR'ı tanımladık. CLas-DETECTR şeması Şekil 1A'da gösterilmiştir.
CLas-enfekte olmuş ve HLB-enfekte olmamış Newhall ağaçlarından (Şekil 1B), CLas-DETECTR testine tabi tutulduğunda, HLB-enfekte olmuş numunede yeşil bir floresan sinyali görüldü, ancak HLB-enfekte olmamış numunede ve negatif kontrolde görülmedi (<stron...

Bu çalışmada, Candidatus Liberibacter asiaticus için CRISPR-Cas12a ile kombine rekombinaz polimeraz amplifikasyonuna dayanan hızlı, hassas ve taşınabilir bir tespit yöntemi geliştirilmiştir.

CRISPR-Cas12a ile Kombine Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyonu Kullanılarak Sahada Konuşlandırılabilir Candidatus Liberibacter asiaticus Tespiti

The early detection of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) by citrus growers facilitates early intervention and prevents the spread of disease. A ...

Huang long bing, HLB olarak kısaltılmıştır. Dünya çapında yıkıcı bir narenciye hastalığıdır. Çin ve ABD gibi en narenciye üreten ülkelerde, HLB'ye CLas olarak kısaltılan floem kısıtlamalı bakteri Candidatus Liberibacter asiaticus neden olur.CLas'ın erken teşhisi, erken müdahaleyi kolaylaştıran ve hastalığın yayılmasını önleyen yetiştiriciler için önemliydi. Bu yüzden burada hızlı ve taşınabilir HLB tanısı için rekombinaz polimeraz amplifikasyonu ve CRISPR-Cas12a sistemi ile birleşen yeni bir yöntem geliştirdik. Biz buna CLas-DETECTR adını verdik.Platformumuzun hassasiyeti PCR'den çok daha yüksektir. Ayrıca, yaprak örnekleri kullanıldığında qPCR ile benzer sonuçlar gösterir. Geleneksel CLas algılamalarıyla karşılaştırıldığında, yöntemimiz 90 dakika içinde tamamlanabilir ve izotermal bir durumda çalışır.Sonuç, sahadaki bir el tipi floresan algılama cihazı aracılığıyla da görselleştirilebilir. CLas-DETECTR dört adımdan oluşur: çözelti hazırlama, narenciye toplam DNA izolasyonu, izotermal DNA amplifikasyonu ve görselleştirme sonuçları. CLas-DETECTR testinin şeması burada gösterilmiştir.Tampon A, Çözüm B ve Çözüm C, protokolde açıklandığı gibi hazırlanır. Zamandan tasarruf etmek ve bu yöntemi alan CLas tespiti için uygun hale getirmek için, DNA amplifikasyonu için ham bitki özleri elde etmek için E.coli polietilen glikol bazlı yaklaşım kullanılmıştır. Narenciye yaprakları alette kullanılır.Birkaç parça yaprak diskini yapraktan delin. Yaprak diskleri 1,5 mililitrelik bir Eppendorf tüpüne koyun. Ardından, tüpe 200 mikrolitre Tampon A ekleyin.Yaprak diskleri plastik bir çubukla pürüzsüz hale gelene kadar manuel olarak öğütün. Tüpü 10 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın. Süpernatant daha sonra DNA amplifikasyonuna uygulanır.İzotermal DNA amplifikasyonu için, adım 2.3'ten bir mikrolitre süpernatant ve bir mikrolitre magnezyum asetat çözeltisi B'ye ekleyin ve iyice karıştırın. Laboratuvarda, onları 15 dakika boyunca 37 derecede basit bir inkübatörde inkübe edin. Sonuçları görselleştirmek için, 3.2. adımdan itibaren 10 mikrolitre karışımı çözelti C'ye ekleyin ve iyice karıştırın.Onları 37 derecelik inkübatörde 60 dakika boyunca inkübe edin. Bir gözlük takın ve el tipi bir floresan algılama cihazı aracılığıyla yeşil floresan sinyalini gözlemleyin. CLas-DETECTR'ın özgüllüğünü test etmek için, Agrobacterium tumefaciens GV3101'in ilk saf kolonileri, Xanthomonas citri subsp.Laboratuvarımızda izole edilen citrus canker ve Burkholderia stabilis suşu 1440'ın patojeni olan sitri, genomik DNA'larını çıkarmak için kullanıldı. Daha sonra bu üç bakteri genomik DNA'sı ve CLas-pozitif Newhall yaprakları genomik DNA'sı CLas-DETECTR testine tabi tutuldu. CLas-DETECTR'ın duyarlılığını test etmek için, protokolde açıklandığı gibi PCR, CLas-DETECTR ve qPCR kullanılarak bir dizi CLas DNA fragmanı seyreltmesi tespit edildi Özgüllük ve duyarlılık testinden sonra, CLas-DETECTR yöntemi CLas'ın sahadaki varlığını tespit etmek için kullanıldı.Gannan Normal Üniversitesi, Jiangxi, Çin kampüsündeki germplazma kaynak fidanlığında yetiştirilen Newhall tatlı portakal ağacından toplanan yaprak örnekleri. qPCR, genellikle laboratuvarda kullanılan ikna edici bir CLas tespit yöntemi de uygulanmıştır. Laboratuvarımızda CLas'ın varlığının doğrulandığı HLB-enfekte ve HLB-enfekte olmamış Newhall ağacından elde edilen yaprak örnekleri, CLas-DETECTR testine tabi tutuldu.Yeşil floresan sinyali, HLB ile enfekte olmuş numunede yakalandı, ancak HLB-enfekte olmamış ve negatif kontrolde yakalanmadı. CLas-DETECTR'ın özgüllüğünü, diğer bakterilerden ekstrakte edilen nükleik asitleri kullanarak belirledik. CLas-DETECTR testinde, sadece CLas-pozitif Newhall yapraklarından ekstrakte edilen gDNA yeşil floresan sinyalleri gösterdi.Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri ve Burkholderia stabilis suşu 1440'tan ekstrakte edilen gDNA, CLas-DETECTR'ın CLas'ı spesifik olarak tespit edebileceği anlamına gelir. Ayrıca CLas-DETECTR'ın duyarlılığını, protokolde listelenen bir dizi CLas DNA seyreltmesi kullanarak test ettik.PCR, megalitre başına 201 kopya tespit edebilir. Öte yandan, CLas-DETECTR megalitre başına 2.01 kopya tespit edebilir ve bu da hassas bir alan teşhisi olarak kullanılabilirliğini gösterir. qPCR, megalitre başına 0,201 kopya algılayabilir ve Ct değeri 36'dan yüksektir.Bu nedenle CLas-DETECTR, geleneksel PCR'den iki büyüklük sırasına göre daha hassastır ve seyreltilmiş CLas'a özgü amplikonlar kullanıldığında qPCR'den daha az hassas bir büyüklük sırasına sahiptir. Son olarak, CLas-DETECTR'ın saha örnekleri için fizibilitesini yeniden inceledi ve duyarlılığını qPCR ile karşılaştırdı. Rakamlarda görüyoruz.CLas konsantrasyonu megalitre başına 0.2 kopyadan az olduğunda Ct değerinin 36'dan yüksek olduğunu görebiliriz, bu da çok düşük bir konsantrasyondur. 15 örneklem arasında, qPCR ile saptanan 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 ve 14 numaralı örneklerin Ct değeri 36'dan azdı. Belirgin bir yeşil floresan sinyalleri gözlendi.Öte yandan, qPCR ile tespit edilen 6, 7, 9, 12 ve 15 örneklerinin Ct değeri belirlenmediğinde, yeşil floresan sinyalleri gözlenmemiştir. Ek olarak, qPCR ile tespit edilen örnek 5 ve 11'in BT değeri 36'dan yüksek olduğunda zayıf yeşil floresan sinyalleri gözlenmiştir. Sonuçlar, platformumuzun sahada HLB teşhisi için hızlı, sağlam ve hassas bir araç olduğunu gösterecektir.

field-deployable-candidatus-liberibacter-asiaticus-detection-using

Research

JoVE Journal

Biology

CRISPR-Cas sistemleri ve anti-CRISPR proteinleri, Saccharomyces cerevisiae'deki Boole kapılarının şemasına entegre edildi. Yeni küçük mantık devreleri iyi performans gösterdi ve hem dCas9 / dCas12a tabanlı transkripsiyon faktörlerinin hem de anti-CRISPR proteinlerinin özelliklerinin anlaşılmasını derinleştirdi.

CRISPR-Cas Sistemlerine ve Anti-CRISPR Proteinlerine Dayalı Gen Dijital Devreleri

DNA virüslerinin eser tespiti için rekombinaz polimeraz amplifikasyonunu bir CRISPR/Cas12a sistemi ile birleştiren bir protokol sunuyoruz ve hasta başı DNA virüsü tespiti için yapay zeka destekli bir sınıflandırma ile taşınabilir akıllı telefon mikroskobu oluşturuyoruz.

RPA-CRISPR/Cas12a-SPM ve Derin Öğrenmeye Dayalı DNA Virüs Tespit Sistemi

Burada, bulaşıcı hastalık patojenlerinin nükleik asit biyobelirteçlerinin tespiti için kullanılabilecek önceden karıştırılmış, liyofilize rekombinaz bazlı izotermal amplifikasyon ve Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR) tabanlı reaksiyonların adım adım hazırlanmasını sunuyoruz.

Önceden Karıştırılmış ve Dondurularak Kurutulmuş Reaktifler ile Bakım Noktası CRISPR Tabanlı Teşhis

Acinetobacter baumannii'nin hızlı ve hassas tespitini kolaylaştırmak için, A. baumannii enfeksiyonlarını tanımlamak için LbaCas12a endonükleaz ile birlikte Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyonu (RPA) kullanan bir protokol sunuyoruz.

Rekombinaz polimeraz amplifikasyonu/Cas12a tabanlı bir sistem kullanılarak Acinetobacter baumannii enfeksiyonlarının hızlı ve spesifik tespiti

Bu protokolde, istilacı bitki patojeni Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropikal ırk 4'ün tespiti için kombine bir rekombinaz polimeraz amplifikasyonu CRISPR/Cas12a testi gösterilmektedir.

Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropikal Irk 4'ün Tespiti için Kombine Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyonu CRISPR/Cas12a Testi

Burada, amplifikasyona hazır hücre lizzi, rekombinaz polimeraz amplifikasyonu ve CRISPR/Cas12a tahlilleri kullanarak Lotmaria passim ve Nosema ceranae gibi arı patojenlerinden DNA'yı tespit etmek için basit ve hızlı bir prosedürü açıklıyoruz.

RPA/CRISPR/Cas12a Sistemine Bağlı Alkalin Lizis Yoluyla Tripanosomatid Parazitlerin ve Nosema ceranae'nin Yerinde DNA Tespiti

Bu video floresan boya ile insan embriyonik kök hücreler ve mezenkimal kök hücreler etiketleme teknikleri gösterir. Bu teknik, in vivo olarak bir optik görüntüleme ile nakledilen kök hücrelerin izleme ve floresan mikroskobu ile histopatolojik korelasyon kullanılabilir.

Optik Görüntüleme ile non-invaziv Algılama için Floresan Boyalar Kök Hücreler Etiketleme

Siteye özgü recombinase (SSR) teknolojisi ve Cre / lox sistemi gelişi, moleküler biyoloji alanındaki birçok gelişmeler açmıştır ve transgenik hayvanların gen fonksiyonunu değerlendirmek için değerli bir araç olarak kendini kanıtlamıştır. Bu röportaj, halka kapanması recombinase (Cre) ve bu enzim kullanımı geleneksel vuruş stratejileri üzerinde önemli avantajlara sahiptir koşullu mutagenez, gelişmesine yol açmıştır sahaya özgü rekombinasyon mekanizması tartışıyor.

Site Özel Recombinase (SSR) Teknoloji İlkeleri

Burada yönettiği, moleküler evrim yoluyla Tre recombinase nesil raporu. Tre recombinase enfekte insan hücreleri provirus eksizyon ve eradikasyon, HIV-1 provirus LTR dizileri içinde önceden tanımlanmış bir hedef sırası tanır. Hala emekleme döneminde olsa da, yönlendirilmiş moleküler evrim moleküler cerrahi ve moleküler tıp araçları olarak hizmet verecek özel enzimlerin yaratılmasına izin verecek.

Tre Recombinase Moleküler Evrim

Günümüzde HIV-1 stratejileri, viral bir yaşam döngüsü bastırmak için değil, etkili bir şekilde enfeksiyonu ortadan kaldırmak hareket ederler. Burada göstermektedir ki enfekte hücreleri genom bir mühendislik recombinase verimli tüketim entegre HIV-1 proviral DNA.

Röportaj: Evolved Recombinase kullanarak HIV-1 Proviral DNA eksizyonu

Öğrenin, sitrus bitkilerinde Huanglongbing hastalığına neden olan Candidatus Liberibacter asiaticus'un saha koşullarında hızlı ve hassas tespiti için CRISPR-Cas12a ile kombine rekombinaz polimeraz amplifikasyonu yöntemini.

CRISPR-Cas12a ile Kombine Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyonu Kullanılarak Sahada Konuşlandırılabilir Candidatus Liberibacter asiaticus Tespiti (Video) | JoVE Journal

CRISPR-Cas12a ile Kombine Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyonu Kullanılarak Sahada Konuşlandırılabilir Candidatus Liberibacter asiaticus Tespiti

Daha fazla video keşfet