Name: Fonksiyonel 3D Küresel Hücre Kültürlerinin Yarı Otomatik Fenotipik Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Keşfedin yarı otomatik fenotipik analiz yöntemini, 3D küresel hücre kültürlerinin proteomik ve görüntüleme teknikleriyle karakterizasyonu için. Bu yöntem, biyoreaktörde çok sayıda biyolojik replikanın eşzamanlı üretimine olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Sidoli laboratuvarı, Lösemi Araştırma Vakfı'na (Hollis Brownstein Yeni Araştırmacı Araştırma Bursu), AFAR'a (Sagol Network GerOmics ödülü), Deerfield'a (Xseed ödülü), Relay Therapeutics'e, Merck'e ve NIH Direktörlük Ofisi'ne (1S10OD030286-01) minnetle teşekkür eder.

<ol><li>Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture+systems%3A+advantages+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">3D cell culture systems: advantages and applications.</a> Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).</li>
<li>Nirmalanandhan, V. S., Duren, A., Hendricks, P., Vielhauer, G., Sittampalam, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+anticancer+agents+in+a+three-dimensional+cell+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Activity of anticancer agents in a three-dimensional cell culture model.</a> Assay and Drug Development Technologies. 8 (5), 581-590 (2010).</li>
<li>Erickson, I. E., Huang, A. H., Chung, C., Li, R. T., Burdick, J. A., Mauck, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+maturation+and+structure-function+relationships+in+mesenchymal+stem+cell-+and+chondrocyte-seeded+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Differential maturation and structure-function relationships in mesenchymal stem cell- and chondrocyte-seeded hydrogels.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (5), 1041-1052 (2009).</li>
<li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10 (29), (2012).</li>
<li>Liu, J., Abate, W., Xu, J., Corry, D., Kaul, B., Jackson, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroid+cultures+of+A549+and+HepG2+cells+exhibit+different+lipopolysaccharide+%28LPS%29+receptor+expression+and+LPS-induced+cytokine+response+compared+with+monolayer+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroid cultures of A549 and HepG2 cells exhibit different lipopolysaccharide (LPS) receptor expression and LPS-induced cytokine response compared with monolayer cultures.</a> Innate Immunity. 17 (3), 245-255 (2011).</li>
<li>Khafaga, A. F., Mousa, S. A., Aleya, L., Abdel-Daim, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+%283D%29+cell+culture%3A+a+valuable+step+in+advancing+treatments+for+human+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional (3D) cell culture: a valuable step in advancing treatments for human hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Cell International. 22 (1), 243(2022).</li>
<li>Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma.</a> The Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).</li>
<li>Sia, D., Llovet, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+cancer%3A+Translating+%27-omics%27+results+into+precision+medicine+for+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver cancer: Translating '-omics' results into precision medicine for hepatocellular carcinoma.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (10), 571-572 (2017).</li>
<li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+cell+biology+model+of+human+hepatocellular+carcinoma+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour+Biology%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional cell biology model of human hepatocellular carcinoma in vitro.</a> Tumour Biology. 32 (3), 469-479 (2011).</li>
<li>van Zijl, F., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatospheres%3A+Three+dimensional+cell+cultures+resemble+physiological+conditions+of+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatospheres: Three dimensional cell cultures resemble physiological conditions of the liver.</a> World Journal of Hepatology. 2 (1), 1-7 (2010).</li>
<li>Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+systems+as+an+in+vitro+platform+for+cancer+and+stem+cell+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling.</a> World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).</li>
<li>Wrzesinski, K., Fey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+and+the+recovery+of+physiological+functionality+in+3D+cultures+in+micro-bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%28Basel%2C+Switzerland%29%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors.</a> Bioengineering(Basel, Switzerland). 5 (1), 22(2018).</li>
<li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture%3A+The+missing+link+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).</li>
<li>Kapalczynska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Medical+Science%3A+AMS%22%5BJournal%5D)">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science: AMS. 14 (4), 910-919 (2018).</li>
<li>Wrzesinski, K., Frandsen, H. S., Calitz, C., Gouws, C., Korzeniowska, B., Fey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinostat+3D+cell+culture%3A+Protocols+for+the+preparation+and+functional+analysis+of+highly+reproducible%2C+large%2C+uniform+spheroids+and+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Clinostat 3D cell culture: Protocols for the preparation and functional analysis of highly reproducible, large, uniform spheroids and organoids.</a> Methods in Molecular Biology. 2273, 17-62 (2021).</li>
<li>Joseph-Chowdhury, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+level+quantification+of+histone+post-translational+modifications+in+a+3D+cell+culture+model+of+hepatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Global level quantification of histone post-translational modifications in a 3D cell culture model of hepatic tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 183, 63606(2022).</li>
<li>Wrzesinski, K., Fey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((After+trypsinisation%2C+3D+spheroids+of+C3A+hepatocytes+need+18+days+to+re-establish+similar+levels+of+key+physiological+functions+to+those+seen+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Research%22%5BJournal%5D)">After trypsinisation, 3D spheroids of C3A hepatocytes need 18 days to re-establish similar levels of key physiological functions to those seen in the liver.</a> Toxicology Research. 2, 123-135 (2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClueGO%3A+a+Cytoscape+plug-in+to+decipher+functionally+grouped+gene+ontology+and+pathway+annotation+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks.</a> Bioinformatics. 25 (8), 1091-1093 (2009).</li>
<li>Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenomics%3A+The+next+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Phenomics: The next challenge.</a> Nature Reviews. Genetics. 11 (12), 855-866 (2010).</li>
<li>Gonneaud, A., Asselin, C., Boudreau, F., Boisvert, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+organoids+by+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of organoids by proteomics.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li>
<li>Avelino, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics+of+3D+cell+culture%3A+A+useful+tool+to+validate+culture+of+spheroids+and+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics of 3D cell culture: A useful tool to validate culture of spheroids and organoids.</a> SLAS Discovery. 27 (3), 167-174 (2022).</li>
<li>Chiang, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChiang%2C+J+%22Liver+physiology%3A+Metabolism+and+Detoxification.+Pathobiology+of+Human+Disease%22">Liver physiology: Metabolism and Detoxification. Pathobiology of Human Disease</a>. McManus, L. M., MitchellIn, R. N. , Academic Press, Elsevier, San Diego. 1770-1782 (2014).</li>
<li>Begriche, K., Massart, J., Robin, M. A., Borgne-Sanchez, A., Fromenty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+toxicity+on+mitochondria+and+lipid+metabolism%3A+Mechanistic+diversity+and+deleterious+consequences+for+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Drug-induced toxicity on mitochondria and lipid metabolism: Mechanistic diversity and deleterious consequences for the liver.</a> Journal of Hepatology. 54 (4), 773-794 (2011).</li>
<li>Fey, S. J., Korzeniowska, B., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+to+and+recovery+from+treatment+in+human+liver-mimetic+clinostat+spheroids%3A+a+model+for+assessing+repeated-dose+drug+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Research%22%5BJournal%5D)">Response to and recovery from treatment in human liver-mimetic clinostat spheroids: a model for assessing repeated-dose drug toxicity.</a> Toxicology Research. 9 (4), 379-389 (2020).</li>
<li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+image+analysis+software+tools+for+exploring+and+understanding+big+image+data+from+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Phenotypic image analysis software tools for exploring and understanding big image data from cell-based assays.</a> Cell Systems. 6 (6), 636-653 (2018).</li>
</ol>

Helle Sedighi Frandsen, ClinoStar sisteminin üreticisi CelVivo ApS'de araştırmacı bilim adamı olarak çalışmaktadır. Karoline Mikkelsen, CelVivo ApS'de çalışan ve doktora çalışmasını SDU, Odense, Danimarka'da yapan bir endüstri doktora öğrencisidir. Diğer tüm yazarların rekabet eden mali çıkarları yoktur.

Üç boyutlu (3D) hücresel yapıların arkasındaki biyolojiyi anlamak, işlevleri hakkında daha kapsamlı bilgi için son derece önemlidir. Karmaşık biyolojiyi incelemek ve toksisite taraması yapmak için 3B modellerin kullanılmasına artan bir ilgi var. Hücreleri 3D olarak yetiştirirken, model sistemin fenotipik değerlendirmesi de dahil olmak üzere birçok faktörün dikkate alınması gerekir. Bir fenotip, belirli bir organizmanın morfolojisi, davranışı, fizyolojik ve biyokimyasal özellikleri gibi gözlemlenebilir özellikleri grubu olarak tanımlanır20.
Bu protokolde, proteomik deneylerin birkaç sferoidden nasıl yapılabileceğini ve tipik karaciğer fenotipini izlemek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Kütle spektrometresi, 3D hücre karakterizasyonu için yaygın olarak uygulanan bir yöntem haline geldi ve çeşitli biyolojik sorularınaraştırılmasına izin verdi 12,16,21,22. Kapsamlı bir proteom analizi için, kütle spektrometresine 1 μg enjekte edilen en az 20 μg protein başlangıç materyali kullanılması önerilir. Daha az numune eklemenin hassasiyet kaybına yol açabileceğini ve daha fazla numune eklemenin kromatografinin kalitesini kademeli olarak kötüleştireceğini ve sonunda kolonun tıkanmasına yol açacağını belirtmek önemlidir. Bu çalışmada, HepG2/C3A ve THLE-3 sferoidlerinin, spesifik karaciğer yolları olan ve kan şekeri düzeylerini korumak ve enerji üretimi için kritik olan glikoliz ve TCA döngüsünden önemli proteinlerle zenginleştirildiğini gösterdik23,24. Aslında, kütle spektrometresi analizi sadece protein düzeyinde bilgi sağlamakla kalmaz, aynı zamanda daha öncegrubumuz 16 tarafından gösterildiği gibi, protein translasyon sonrası modifikasyonların araştırılmasına da izin verir.
3 boyutlu fenotipik çalışmalarda dikkat edilmesi gereken bir diğer husus da sferoidlerin sayısı ve boyutudur. Deneyleri daha tekrarlanabilir hale getirmenin yanı sıra, bir kap içindeki 3D yapıların sayısı sferoidlerin boyutunu ve metabolik aktivite seviyelerini etkileyebileceğinden, kültürün ne zaman çoklu biyoreaktörlere bölüneceğini belirlemek için sferoidlerin sayısını saymak ve boyutlarını belirlemek çok önemlidir. Bununla birlikte, sferoidlerin sayısının ve boyutunun hücre hattına, başlangıç hücre sayısına, bölme işlemine ve toplama zamanına bağlı olduğunu vurgulamak önemlidir. HepG2 / C3A küresel kültürünün, sferoid başına hücre sayısı, protein içeriği ve yaşın bir fonksiyonu olarak büyüklüğü gibi ayrıntıları Fey, Korzeniowska ve Wrzesinski25 tarafından sağlanmıştır. Burada açıklanan yarı otomatik yöntemi kullanarak doğru ve başarılı bir analiz için en kritik adım iyi bir sferoid resmidir. Basitlik için, resim bir telefon veya tablet ile çekilebilir, ancak çözünürlüğü mümkün olduğunca yüksek tutulmalıdır. Görüntülerin elde edilmesi hızlı olduğundan, belirli fenotipik özellikleri görselleştirmek veya ilaç tedavisine verilen yanıtları araştırmak için büyük ölçekli tarama deneylerine izin verirler. Bu nedenle, hücre tabanlı tahlillerin sayısının artması nedeniyle, son 10 yılda görüntü analizi için bir dizi açık kaynaklı yazılım geliştirilmiştir26. Bu protokolde, sferoidlerin boyutlarını saymak ve ölçmek için FIJI18 yazılımını kullanan yarı otomatik bir sistemi tanımlıyoruz. Bir görüntü koleksiyonuna uygulanabilecek bir dizi algoritmik işlem tanımlamak için komut dosyaları (basit programlama komutları) sunduk ve analizi kolay ve hızlı bir süreç haline getirdik. Bununla birlikte, sferoidin özelliğine bağlı olarak, manuel bir ölçüm kullanılmalıdır. Örneğin, sferoidler çok yarı saydamsa, FIJI yazısı kesin olmayacaktır. Bu arada, bu yöntemin çalışması için en önemli kriterlerden biri sferoidlerin kompaktlığıdır. Bu özellik, yöntemin doğru olması için gerekli olan sferoidler ve arka plan arasında daha gelişmiş bir renk kontrastına katkıda bulunacaktır.
Özetle, yüksek tekrarlanabilirliğe sahip sferoidlerin yetiştirilmesi için bir metodoloji sunmanın yanı sıra, görüntü yakalama ve proteomik yoluyla fenotipik karakterizasyon ile birleştirilmiş yarı otomatik bir sistem de tanımlanmıştır. 3D hücreleri analiz etmek için bu araç kutusunun, tam otomatik görüntü analiz yazılımı ve yeni nesil kütle spektrometreleri ile daha sağlam hale gelmesini bekliyoruz.

İn vitro hücre kültürlerinin biyolojide temel bilgilerin oluşturulmasında gerekli ve paha biçilmez olduğu kanıtlanmıştır. Biyoloji ve kanserdeki bilimsel anlayışın çoğu, özellikle tek tabakada büyüyen hücreler olan 2D kültür sisteminden gelmiştir. 2D kültür, baskın hücre kültürü sistemi olmasına rağmen, potansiyel olarak daha fazla biyolojik ilerlemeyi engelleyebilecek birçok dezavantaja sahiptir. Örneğin, 2D kültürler, hücre sinyalizasyonu ve proliferasyonu için önemli olan hücre-hücre etkileşimlerinden yoksundur1. Bugüne kadar, 3D kültür sistemlerinin farklılaşmayı, ilaç yanıtını, tümör invazyonunu ve biyolojiyi daha iyi modellediği gösterilmiştir 2,3,4,5. Kötü huylu kanserlerin 3 boyutlu modellenmesi, yaşlanan nüfus ve kanser ölümlerindeki artış nedeniyle özellikle hayati önem taşımaktadır. Hepatosellüler karsinom (HCC), dünya çapında kansere bağlı mortalitenin önde gelen nedenlerinden biridir ve sıklıkla berbat bir prognoza sahiptir6. HCC'nin düşük kür oranına, zayıf ilaç yanıtına ve yüksek tekrarlama oranına sahip olduğu bilinmektedir 6,7,8. Normal karaciğer ve HCC için in vivo normal ve malign karaciğer dokusunun fizyolojisini taklit eden çeşitli 3D modeller geliştirilmiştir 9,10.
Mevcut 3D sistemlerden bazıları sıvı kaplamalar, biyoreaktörler, hidrojel, iskeleler ve 3D baskılı yapıları içerir. Biyoreaktörlerde üretilen sferoidler, besin maruziyetinin, gaz değişiminin ve hücre proliferasyonunun/sessizliğinin tümör dağılımını taklit ettikleri için özellikle benzersiz avantajlar sağlar11. Biyoreaktörler, kullanım kolaylıkları, büyük ölçeklenebilirlikleri, besin yayılımları ve erişilebilirlikleri nedeniyle özellikle kanser modelleri için uygundur11. Ek olarak, biyoreaktörler yüksek verimli deneylere, daha fazla tekrarlanabilirliğe ve daha az insan hatasına izin verebilir. Bu çalışmada kullanılan biyoreaktör benzersizdir, çünkü tipik biyoreaktörlerde uygulanan yıkıcı kesme kuvvetlerini en aza indirgeyen ve daha iyi tekrarlanabilirlik sağlayan azaltılmış yerçekimi sistemini simüle eder12. Çok yönlü yerçekimi ve kesme kuvvetlerindeki azalma, hücrelerin daha fizyolojik bir şekilde gelişmesine izin verir. Kanıt olarak, bu metodoloji altında büyütülen HepG2/C3A hücreleri, in vivo ATP, adenilat kinaz, üre ve kolesterol13,14 seviyeleri üreten küresel organeller geliştirir. Ek olarak, bu 3D sistemdeki ilaç tedavileri, 2D kültürlere kıyasla daha gelişmiş ve otomatiktir. 2D kültürlerde, ilaç tedavileri, hücre sağlığını deneme ve koruma ihtiyacı nedeniyle genellikle kısa bir süreye sahip olmalıdır. Ancak bizim durumumuzda, hücrelerin yapısını ve fizyolojisini bozmaya gerek kalmadan sferoidlerin uzun süreli ilaç tedavilerini gerçekleştirebiliyoruz. Bu nedenle, in vivo biyolojik olayları daha iyi modellemek ve daha fazla bilimsel gelişme için 2B'den 3B'ye geçiş gereklidir.
Bu makale, yüksek tekrarlanabilirliğe sahip sferoidlerin yetiştirilmesi için bir metodoloji sunar (Şekil 1 ve Şekil 2) ve 3D yapıları fenotipik olarak karakterize etmek için yarı otomatik bir sistemi gösterir (Şekil 3). Görüntü düzeyinde, sferoidlerin alanını sayma ve ölçme hakkında bilgi veriyoruz (Şekil 3). Kütle spektrometresi yöntemlerini kullanarak, proteomiklerin spesifik biyolojik fonksiyonları değerlendirmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz (Şekil 4). Bu verileri toplayarak ve analiz ederek, 3D hücre kültürü sistemlerinin arkasındaki biyolojinin anlaşılmasını geliştirmeyi umuyoruz.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Bio-Rad</td><td>2239480</td><td></td></tr><tr><td>10 mL şırınga</td><td>Fisher Scientific</td><td>1481754</td><td>Luer kilit ucu, 12 mL</td></tr><tr><td>1000 & mikro; L geniş çaplı pipet uçları</td><td>Fisher Scientific</td><td>14222703</td><td></td></tr><tr><td>200 & L geniş çaplı pipet uçları</td><td>Fisher Scientific</td><td>14222730</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu Orochem filtre plakası</td><td>Orochem&nbsp;</td><td>OF1100</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu etekli plaka</td><td>Axygen</td><td>PCR-96-FS-C</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu vakum manifoldu</td><td>Millipore</td><td>MAVM0960R</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum bikarbonat</td><td>Sigma</td><td>A6141-25G</td><td></td></tr><tr><td>Bronşiyal Epitel Hücre Büyüme Ortamı (BEGM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü sınıfı su</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>3D hücre kültürü için</td> <td>ClinoReactor</td><td>CelVivo</td><td>N/A</td> Biyoreaktör</tr><tr><td>ClinoStar inkübatörü</td><td>CelVivo</td><td>N/A</td><td>CO2 3D hücre kültürü için inkübatör</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632-5G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT17205CV</td><td></td></tr><tr><td>Elplasia 24 kuyulu yuvarlak tabanlı mikro kuyular içeren ultra düşük bağlantı plakası</td><td>Corning</td><td>4441</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Formik asit</td><td>Thermo</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21022CV</td><td></td></tr><tr><td>hEGF</td><td>Corning</td><td>354052</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell vios 160i</td><td>Thermo</td><td>51033557</td><td>CO2 2D hücre kültürü</td></tr><tr><td>HPLC sınıfı asetonitril</td> için inkübatör <td>Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC sınıfı metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-1</td><td></td></tr><tr><td>HPLC sınıfı su</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>İyodoasetamid</td><td>Sigma</td><td>I1149-5G</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25015CI</td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel olmayan amino asitler</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB Reçine 30 ve mikro; m</td><td>Sular</td><td>186007549</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid kütle spektrometresi</td><td>Thermo</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td><td>Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi</td></tr><tr><td>PAULA mikroskobu</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT3002CI</td><td></td></tr><tr><td>PerkinElmer Victor X2 çok etiketli mikroplaka okuyucu</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH kağıdı</td><td>Hydrion</td><td>93</td><td></td></tr><tr><td>Fosfoetanolamin</td><td>Sigma</td><td>P0503</td><td></td></tr><tr><td>Fosforik asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>A260-500</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tabancası</td><td>Eppendorf</td><td>Z666467 (Milipore Sigma)</td><td></td></tr> <tr><td>Soğutmalı santrifüj</td><td>Thermo</td><td>75-217-420</td><td></td></tr><tr><td>Reprosil-Pur reçinesi</td><td>MSWIL</td><td>R13. AQ.003</td><td>120 &Aring; gözenek boyutu, C18-AQ fazı, 3 & mu; M boncuk boyutu</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610301</td><td></td></tr><tr><td>Sıralama sınıfı modifiye tripsin</td><td>Promega</td><td>V511A</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac vakum konsantratörü (96 kuyucuklu plakalar)</td><td>Thermo</td><td>15308325</td><td>Savant SPD1010</td></tr><tr><td>Steril başlık</td><td>Thermo</td><td>1375</td><td></td></tr><tr><td>Steril serolojik pipetler</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367549</td><td></td></tr><tr><td>S-trap</td><td>Protifi</td><td>C02-micro-80</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga iğnesi (18 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14817100</td><td>3 "uzunluk, 0.05" çap</td></tr><tr><td>Trifloroasetik asit (TFA)</td> <td>Thermo</td><td>28904</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks</td><td>Sigma</td><td>Z258415</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>FSGPD10</tr></tbody></table>

fonksiyonel 3d küresel hücre kültürlerinin yarı otomatik fenotipik analizi

Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures

3D hücre kültürlerini büyütmek, tedavi etmek ve izlemek için bağımsız bir klinostat inkübatörü kullanmanın özelliklerini ve avantajlarını açıklayan bir protokol sunuyoruz. Klinostat, hücrelerin düşük kesme kuvvetleri ve aktif besin difüzyonu ile yüksek oranda tekrarlanabilir sferoidler olarak bir araya gelebildiği bir ortamı taklit eder. Hem kanserli hem de kanserli olmayan hepatositlerin (HepG2/C3A ve THLE-3 hücre hatları) karaciğer hücreleriyle karşılaştırılabilir işlevlere ulaşmadan önce 3 haftalık büyüme gerektirdiğini gösterdik. Bu protokol, hücre büyümesini izleyen kameralara sahip 3D hücreler için inkübatörlerin kullanılmasının rahatlığını vurgulamaktadır, çünkü tedavi sırasında sferoidleri saymak ve ölçmek için anlık görüntüler alınabilir. THLE-3 ve HepG2/C3A hücre hatlarının karşılaştırılmasını, kanserli olmayan hücre hatlarının ve ölümsüzleştirilmiş kanser hücrelerinin nasıl büyütülebileceğini gösteriyoruz. Proteomik deneylerin, hücre sinyalini bozmadan, yani tripsinizasyon gerektirmeden toplanabilen birkaç sferoidden nasıl yapılabileceğini gösteriyor ve gösteriyoruz. Proteomik analizin, solunum zinciri metabolizmasının tipik karaciğer fenotipini ve metal detoksifikasyonunda yer alan proteinlerin üretimini izlemek için kullanılabileceğini ve sferoid alanını saymak ve ölçmek için yarı otomatik bir sistemi tanımlamak için kullanılabileceğini gösterdik. Toplamda, protokol, görüntü yakalama yoluyla fenotipik bir karakterizasyon ve 3D hücre kültürü modelleri üzerinde deney yapmak için bir proteomik boru hattı içeren bir araç kutusu sunar.

Bu protokolde, özellikle 3D sferoidlerin kültürlenmesi için tasarlanmış bir sistem olan yenilikçi, stressiz bir 3D hücre inkübatörünün özelliklerini açıklıyoruz (Şekil 2). THLE-3 ve HepG2/C3A hücre hatlarının 3D kültürü için protokolü optimize ettik. Burada açıklanan protokolün kullanımı kolaydır ve biyoreaktör başına &gt; 100 sferoidin tekrarlanabilirliğine ve uygun maliyetli kültürüne izin verir. Biyoreaktöre girdikten sonra, sferoidler 2D kültürde tutulan hücrelere benzer şekilde muamele edilir. Optimum büyüme koşulları, ortamın haftada iki ila üç kez değiştirilmesiyle (Şekil 2B) ve dönüş hızının sferoidlerin büyümesine ve boyutuna göre ayarlanmasıyla elde edilir (Şekil 2C). 3 boyutlu sferoidlerin dönen biyoreaktörlerde kültürlendiği bu sistem (Şekil 2E,F), sferoidi eşit ve çok düşük miktarda kesme kuvvetine maruz bırakarak 3 boyutlu yapılar için optimal bir büyüme ortamı sağlar.
Kromatin modifikasyonu16'nın analizi için sferoidlerin nasıl kullanılabileceğini daha önce göstermiştik. Burada, karaciğer sferoidlerinin nasıl elde edileceğini ve tam proteomun analizi için proteomik deneylerin nasıl yapılabileceğini ayrıntılı olarak gösteriyoruz (Şekil 1<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig01large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig02v2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig02largev2.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig03large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig04.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig04large.jpg" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/Supplementary%20File%202.docx" target="_blank"></a>

Görüntü yakalama ve proteomik kullanarak yüksek tekrarlanabilirliğe sahip sferoidlerin yetiştirilmesi ve fenotipik karakterizasyonu için bir protokol sunuyoruz.

Fonksiyonel 3D Küresel Hücre Kültürlerinin Yarı Otomatik Fenotipik Analizi

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell ...

Bu protokol, yüksek oranda tekrarlanabilir sferoidlerin nasıl yetiştirileceğini ve 3D yapıların biyolojik işlevini karakterize etmek için proteomik deneylerin nasıl yapılabileceğini gösterir. 3D kültürümüz aynı biyoreaktörde aynı anda yüzlerce biyolojik kopya üretebilir ve LC-MS yaklaşımı, tek bir deneyde binlerce proteinin bolluğunu ölçebilir. Prosedürü gösteren, laboratuvardan bir postdoc olan Stephanie Stransky olacak.Başlamak için, HepG2 / C3A ve THLE-3 hücrelerinin süspansiyonunu alın. Hücre sayısını sayın ve maksimum 1.5 mililitre hacimde 1 milyon hücre elde etmek için hücre süspansiyonunu tam büyüme ortamında seyreltin. Ultra düşük ataşman, 24 oyuklu yuvarlak alt plakanın kuyularını 0,5 mililitre büyüme ortamı ile yıkayın ve beş dakika boyunca 3.000 g'da santrifüjleyin.Hücre süspansiyonunu plakaya aktarın ve 120 g'da üç dakika santrifüjleyin. Ardından, küresel oluşumu başlatmak için plakayı inkübe edin. Daha sonra, uzun bir iğne ile 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak nem odasını 25 mililitre steril su ve hücre odasını dokuz mililitre büyüme ortamı ile doldurarak sferoidleri aktarmadan 24 saat önce biyoreaktörü dengeleyin.Ardından, biyoreaktörü %5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede 24 saat boyunca 3D inkübatöre yerleştirin. Sferoidleri ultra düşük bağlantı plakasından ayırmak için bir mililitre genişliğinde delikler kullanarak yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin ve bir doku kültürü kabına aktarın. Kalan sferoidleri yakalamak için, plakayı 0,5 mililitre önceden ısıtılmış büyüme ortamı ile yıkayın ve bunları kültür kabına aktarın.Bir ışık mikroskobu kullanarak, yeterince şekillendirilmiş olanları seçmek için sferoidlerin boyutunu, kompaktlığını ve yuvarlaklığını değerlendirin. Seçilen sferoidi, beş mililitre taze büyüme ortamı ile doldurulmuş dengeleyici biyoreaktöre aktarın. Ardından, tüm biyoreaktörü taze büyüme ortamıyla doldurun.Biyoreaktörü 3D inkübatöre yerleştirin ve kontrol ünitesini kullanarak dönüş hızını ayarlayın. Her iki ila üç günde bir 10 mililitre eski büyüme ortamını 10 mililitre taze ortamla değiştirin. Ortamı değiştirdikten sonra her seferinde dönüş hızını değiştirin.Sferoidleri 15 gün boyunca kültürleyin ve iki yeni biyoreaktör arasında bölün. Tablette yüklü olan 3D uygulamasını açın, biyoreaktörü seçin ve görüntüyü yakalayın. Alternatif olarak, biyoreaktörün arkasına siyah bir arka plan yerleştirin ve hücre odasına ışık yansımadığından emin olun.Görüntüyü biyoreaktöre mümkün olduğunca yakın bir şekilde yakalayın. Ardından, üst porttan uzun bir iğneye bağlı bir şırınga kullanarak biyoreaktörden beş mililitre ortam çıkararak sferoidleri toplayın. Kürelerin biyoreaktörün alt merkezine indiğinden emin olun.Şimdi, ön portu açın ve bir mililitre genişliğinde bir delik ucu kullanarak sferoidleri toplayın. Bu sferoidleri mikro santrifüj tüplerine aktarın, 500 g'da beş dakika santrifüjleyin ve ortamı atın. FBS'yi çıkarmak için 200 mikrolitre HBSS ekleyerek sferoidi yıkayın.Bundan sonra, beş dakika boyunca 500 g'de santrifüjleme yapın ve süpernatanı atın. Daha sonra, küresel peleti dondurmak için hızla sıvı nitrojene daldırın ve bu donmuş peleti daha sonraki işlemlere kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Hücreleri parçalamak için, toplanan sferoidlerden oluşan bir tüp alın ve bunları 25 mikrolitre% 5 SDS içinde yeniden süspanse edin.Yukarı ve aşağı pipetleyerek peleti homojenize edin. Daha sonra, bir mikrogram numuneyi ve 10 mikrolitre% 0.1 trikloroasetik asidi çözün. Proteini çıkardıktan ve numuneleri temizledikten sonra, tanımlanan peptit sinyallerinden MS/MS spektrumlarını oluşturmak için MS toplama yöntemini ayarlayın.Ardından, plakayı nanolitre sıvı kromatografi otomatik örnekleyiciye aktarın. Orbitrap'te tam MS taramasını 300'e 1, 100 kütle-şarj oranına ayarlayın. Çözünürlüğü 120000 olarak ayarlayın ve otomatik kazanç kontrol hedefini 125 olarak ayarlayın.Ardından, MS/MS'yi Orbitrap'te 50 kütle-yük oranına sahip sıralı bir izolasyon penceresiyle ayarlayın. Otomatik kazanç kontrol hedefini 400'e hedefleyin ve 30'luk daha yüksek bir enerjili çarpışma ayrışma enerjisi ayarlayın. Sferoidlerin canlılık analizine göre, adenilat kinaz seviyeleri 17. güne kadar artar ve hücre ölümünün yaklaşık% 7'sine neden olur.Daha sonra, ölüm oranı %5'in altına düşerAyrıca, ilk ana bileşenin analizi, sferoid numuneler ile düz hücre kültürleri arasında net bir ayrım ortaya koymaktadır. Proteomik analiz, THLE-3 ve HepG2/C3A sferoidlerinin karaciğer fonksiyonunu yansıtan benzer profillere sahip olduğunu gösterdi. Ek olarak, sferoidler, düz hücrelere kıyasla iki metallotiyonin izoformunun aşırı ekspresyonunu gösterdi.İşlevsel olarak gruplandırılmış ağlar, HepG2/C3A ve THLE-3 kürelerinde karbonhidrat metabolik süreci için gen ontolojisi zenginleşmesi gösterdi. Büyüme ortamının dökülmesini önlemek için, hücre odası tamamen sıvıyla dolduğunda ön bağlantı noktasını açmayın veya kapatmayın. Bu protokolde açıklanan numune hazırlama ve analiz, doku örneklerinin yanı sıra 2D ve 3D yöntemler kullanılarak hücre kültürünün proteomunu keşfetmek için kullanılabilir.

semi-automated-phenotypic-analysis-functional-3d-spheroid-cell

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Spheroids, 2B hücre kültürü tek katmanlı modellere kıyasla bir hücrenin ortamını daha doğru bir şekilde temsil etmek için kullanılan bir tür 3B hücre kültürü modelidir. Örnek protokolde, bilim adamlarının bir kolorektal kanser hücre hattından sferoidler ürettiğini ve sferoidlerin büyümesini izlemek için canlı hücre görüntüleme uyguladığını göreceğiz.

Hücre Hatlarından Küresel Üretim: Üç Boyutlu (3D) Bir Hücre Kültürü Yöntemi

Klinik öncesi testlerden insan denemelerine geçiş yapan yeni ilaç hedeflerinin belirlenmesi bilimsel bir önceliktir. Bu amaçla, burada, gen tükenmesinin kanser hücre hattı sferoidleri üzerindeki etkisini incelemek için işlevsel bir genomik yaklaşımı tanımlıyoruz, bu da insan kanserlerini in vivo olarak daha uygun bir şekilde modelliyor.

İşlevsel Genomik Tarama kullanılması Kanser Hücre Sfero Kültürleri Potansiyel Yeni İlaç Hedefleri Belirlemek İçin

Burada, hücre agregasyonu yoluyla 3B hücre sferoidlerinin oluşumu için hızlı ve esnek bir protokol açıklıyoruz. Bu, birden fazla hücre tipine kolayca uyarlanır ve hücre göçü, istila veya anoikis tahlilleri dahil olmak üzere çeşitli uygulamalarda ve hücre-matris etkileşimlerini görüntülemek ve ölçmek için uygundur.

3D Sfero Üretim için bir Verimli ve esnek Hücre Toplama Yöntemi

Burada, pankreas kanseri hücreleri ve metabolik fonksiyonların bir hücre dışı akı çözümleyicisini kullanarak ölçüm tarafından takip fibroblastlar, 3 boyutlu (3D) küresel ortak kültür hazırlanması için bir yöntemi açıklanmıştır.

Hazırlık ve pankreas kanseri hücreleri ve fibroblastlar 3 boyutlu küresel ortak kültürlerin metabolik tahlil

Bu protokol, ilacın belirlenmesi için, hastanın türetildiği kürlerin oluşumunu, proliferasyonun ölçülmesi, sitotoksisite testi, akış sitometri, immünofluoresesans boyama ve konfoksel görüntüleme gibi aşağı akış analizini açıklar. anti-neoplastik terapötik olarak adayların potansiyeli. Bu protokol her hasta ve hastalığın aşaması için spesifik ilaçların tanımlanması ile hassas ilacı destekler.

Fizyolojik hasta, kanser kök hücrelerini hedef alan anti-neoplastik Ilaç taraması için 3B kürler türetilmiştir

Biz hücre küresel leri yetiştirmek için bir motor destekli santrifüj mikroakışkan cihaz satıyoruz. Bu cihazı kullanarak, tek veya birden fazla hücre tiplerinin küresel leri yüksek yerçekimi koşullarında kolayca cokültüre edilebilir.

Çok Hücreli Üç Boyutlu Spheroidler Üretmek için Lab-on-a-CD Platformu

Sunulan yaklaşım aynı anda 3D spheroid tahliller ve T-hücre sitotoksisite kanser hücresi invazyonu değerlendirir. Spheroids bir iskele-free agarose multi-microwell döküm oluşturulur. Eş-kültür ve tip I kollajen matris gömme kanser hücresi invazyonu ve T-hücre aracılı sitotoksisite izlemek için izin veren aynı cihaz içinde gerçekleştirilir.

3D Kültürde Kanser Hücre İstilası ve T-Hücre Sitotoksisitesi İzleme

Bu protokoller, kullanıcıların Denizatı hücre dışı akı analizini kullanarak 3D kanser hücre hattı kaynaklı sferoidlerde mitokondriyal enerji metabolizmasını araştırmalarına yardımcı olacaktır.

Hücre Dışı Akı Analizi Kullanarak Tek 3D Mikrodoku Sferoidlerinin Mitokondriyal Enerji Metabolizmasını Keşfetmek

Bu protokol, üç farklı sferoid tipinin üretimi için bir yöntemi, onları büyük ölçekli yüksek içerikli tarama ve analiz için uygun hale getirecek şekilde detaylandırmaktadır. Ek olarak, küresel ve bireysel hücre seviyelerinde nasıl analiz edilebileceğini gösteren örnekler sunulmaktadır.

Yüksek İçerikli Tarama ve Analiz Uygulamaları için Büyük Ölçekli Sferoid Üretimi için Sağlam Bir Yöntem

Burada, takip çok parametreli canlı hücre mikroskobu gerçekleştirmek için farklı çok hücreli sferoid oluşturma yöntemlerini açıklıyoruz. Floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM), hücresel otofloresan, boyama boyaları ve nanopartiküller kullanılarak, canlı üç boyutlu (3D) kanser ve kök hücre türevli sferoidlerde hücre metabolizması, hipoksi ve hücre ölümünün analizi için yaklaşım gösterilmiştir.

Çok Hücreli Sferoidlerin Üretimi ve Çok Parametreli Canlı Hücre Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu (FLIM)

Burada, üç boyutlu (3D) glioma sferoidlerini ve hücre dışı akı analizi yoluyla görüntülemeye dayalı normalizasyonu entegre eden bir metabolik profilleme platformu oluşturuyoruz. Bu yaklaşım, ilaç tedavilerine tümör metabolik yanıtlarının daha doğru değerlendirilmesini sağlar ve potansiyel direnç mekanizmaları hakkında bilgi sağlar.

İlaç Taraması için Üç Boyutlu Beyin Tümörü Sferoidlerinin Metabolik Profillemesindeki Gelişmeler

Keşfedin yarı otomatik fenotipik analiz yöntemini, 3D küresel hücre kültürlerinin proteomik ve görüntüleme teknikleriyle karakterizasyonu için. Bu yöntem, biyoreaktörde çok sayıda biyolojik replikanın eşzamanlı üretimine olanak tanır.

Fonksiyonel 3D Küresel Hücre Kültürlerinin Yarı Otomatik Fenotipik Analizi

Daha fazla video keşfet