Name: Özel Tamponda Boncuk Çırpma Kullanılarak Mikobakteriyel DNA Ekstraksiyonu ve Ardından NGS İş Akışı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Öğrenin, Mycobacterium tuberculosis örneklerinden boncuk çırpma ve DNA yakalama boncuğu arıtma kullanarak hızlı DNA ekstraksiyonu yöntemini. Bu protokol, düşük kaynaklı ortamlarda NGS uygulamaları için güvenilir ve standartlaştırılmış bir çözüm sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Kaliforniya San Francisco Üniversitesi'nde (UCSF) Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi onayı (BUA #BU198320-01GBUA/BABB) altında yürütülmüştür ve UCSF araştırma etiği yönergelerini takip etmektedir. Discovery Life Sciences tarafından IRB onaylı bir Rıza Feragatnamesi protokolü kapsamında toplanan kalıntı balgam örneklerini, TB dışı solunum rahatsızlığı olan bireylerden aldık.
1. Tamponların hazırlanması
<ol>
	<li>Özel Triton tamponu (Tablo 1): 100 mL özel Triton tamponu hazırlamak için 2 mL 5 M NaCl, 1 mL 1 M Tris-HCl (pH 8), 1 mL Triton X-100 ve 0.2 mL 0.5 M etilendiamintetraasetik asit (EDTA). Toplam hacmi 100 mL'ye getirmek için ultra saf su ekleyin. Kullanmadan önce filtre sterilize edin. Son tampon 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA ve %1 Triton X-100 içerir.</li>
	<li>Düşük EDTA'lı TE (Tablo 2): 100 mL Düşük EDTA'lı TE Tamponu hazırlamak için 1 mL 1M Tris-HCl (pH 8) ve 0.02 mL 0.5 M EDTA'yı birleştirin. Toplam hacmi 100 mL'ye getirmek için ultra saf su ekleyin. Son tampon 10 mM Tris-HCl ve 0.1 mM EDTA içerir.</li>
</ol>
2. Lizis tüplerinin hazırlanması
<ol>
	<li>Bir neşter bıçağı kullanarak, bükülme noktasının hemen altındaki 1,5 mL'lik vidalı kapaklı bir borunun altını dikkatlice kesin.</li>
	<li>Ucu bir P1000 ucundan kesin, ucuna yakın V şeklinde bir kama kesin ve vidalı kapak borusunun hazırlanan tabanını içine sıkıştırın. Kepçe şeması için Şekil 1'e bakın.</li>
	<li>Steril bir kabı (örn. bir rezervuar veya Petri kabı) 0,1 mm Zirkonya-Silikat Boncuklar ile doldurun ve bir kepçe boncuk (~ 200 mg) 1,5 mL vidalı kapaklı tüplere dağıtmak için hazırlanan kepçeyi kullanın.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68037/68037fig1.jpg"> 
Şekil 1: Şirket içi boncuk dağıtım kepçesi. Kepçe, ~ 200 mg 0.1 mm zirkonyum boncukların işleme tüplerine kolayca aktarılması için tasarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68037/68037fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
3. Girdinin hazırlanması
NOT: Tüm numune hazırlama işlemleri tesisinizin biyogüvenlik protokollerine göre yapılmalıdır. Aerosole maruz kalma riskini en aza indirmek için bulaşıcı materyallerin Sınıf II Biyogüvenlik Kabini (BSC) içinde kullanılmasını şiddetle tavsiye ederiz.
<ol>
	<li>Bakteri hücre kültürü<ol>
		<li>~ 5 mL M. tuberculosis kültürünü (MGIT veya bulanık sıvı kültür) 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpünde maksimum hızda (≥ 3.000 x g) 10 dakika boyunca santrifüjleyin.</li>
		<li>10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, peleti bozmadan süpernatantın ~ 500 μL dışındaki tamamını dikkatlice çıkarın. Peleti bozmadan kalan süpernatanı bir P1000 pipeti ile çıkarın.</li>
		<li>Peleti 350 μL'lik özel Triton tamponunda yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Gerekirse (yani, bir BSL-3 dışında işlenmek üzere numuneleri çıkarmak için), numuneyi standart çalıştırma prosedürlerine göre devre dışı bırakın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Balgam hazırlama<ol>
		<li>1-5 mL balgam örneğini (spontan veya indüklenmiş) steril 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DTT sıvılaştırma<ol>
		<li>Balgam örneğine dört hacim 100 mM ditiyotreitol ekleyin (hacim değişebilir). Ticari bir reaktif kullanıyorsanız, üreticinin seyreltme talimatlarına uyun.</li>
		<li>30 saniye boyunca iyice girdaplayın. Oda sıcaklığında (20-25 °C) 7 dakika inkübe edin. 30 saniye boyunca tekrar girdap.</li>
		<li>3.3.1 adımlarını tekrarlayın. ve 3.3.2. 1x, çok viskoz numuneler için 5 adede kadar inkübasyon-girdap döngüsü gerçekleştirin.</li>
		<li>10 dakika boyunca maksimum hızda (≥ 3.000 x g) santrifüjleyin. 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, süpernatantın ~ 500 μL'si hariç hepsini dikkatlice atın. Peleti bozmadan kalan süpernatanı bir P1000 pipeti ile çıkarın.</li>
		<li>Peleti 350 μL özel Triton tamponunda yeniden süspanse edin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NALC-NaOH sıvılaştırma<ol>
		<li>NALC-NaOH çözeltisini hazırlamak için, üreticinin hazırlama ve seyreltme talimatlarını izleyin.</li>
		<li>Balgam örneğine dört hacim NALC-NaOH çözeltisi ekleyin (spontan veya indüklenmiş, hacim değişebilir).</li>
		<li>30 saniye boyunca girdap. Oda sıcaklığında (20-25 °C) 7 dakika inkübe edin. 3.4.1 ve 3.4.2 adımlarını tekrarlayın. 1 kat. Çok viskoz numuneler için 5 adede kadar inkübasyon-girdap döngüsü gerçekleştirin.</li>
		<li>50 mL işaretine PBS ekleyin. Karıştırmak için kısaca girdap. 10 dakika boyunca maksimum hızda (≥ 3.000 x g) santrifüjleyin.</li>
		<li>50 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, süpernatanın ~ 500 μL'si hariç hepsini dikkatlice atın. Peleti bozmadan kalan süpernatanı bir P1000 pipeti ile çıkarın.</li>
		<li>Peleti 350 μL özel Triton tamponunda yeniden süspanse edin. Gerekirse (yani, bir BSL-3 dışında işlenmek üzere numuneleri çıkarmak için), numuneyi standart çalıştırma prosedürlerine göre devre dışı bırakın.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. DNA'nın Ekstraksiyonu
<ol>
	<li>İnaktive edilmiş bakteriyel süspansiyonu (3. adımdan itibaren 350 μL), ~ 250 μL 0,1 mm Zirkonya-Silikat Boncuk içeren, iyi etiketlenmiş 1,5 mL'lik yeni bir vidalı kapaklı tüpe aktarın.</li>
	<li>Bead, koşular arasında 2 dakika dinlenme ile 45 saniye boyunca 6,5 m/s hızla lizatı yendi. Toplam üç boncuk çırpma döngüsü için tekrarlayın.</li>
	<li>2 dakika boyunca maksimum hızda (≥ 12.000 x g) santrifüjleyin ve 150 μL süpernatanı iyi etiketlenmiş yeni bir tüpe aktarın. Boncukları veya hücre kalıntılarını aktarmamaya dikkat edin.</li>
	<li>Temizleme manyetik boncuklarının 30 dakika boyunca oda sıcaklığına dengelenmesine izin verin ve kullanmadan önce tamamen yeniden süspansiyon sağlamak için iyice girdaplayın.</li>
	<li>180 μL (1,2x hacim) temizleme manyetik boncukları ekleyin ve 10 kat yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Manyetik bir rafa yerleştirin ve çözeltinin ~ 2 dakika boyunca temizlenmesini bekleyin. Bir P200 pipeti kullanarak, manyetik boncukları bozmadan süpernatanı dikkatlice atın.</li>
	<li>Tüp hala manyetik rafın üzerindeyken, 500 μL taze hazırlanmış p (h/h) etanol ekleyin ve karşı tüp duvarı boyunca manyetik boncuklara dağıtın. 30 saniye bekleyin.</li>
	<li>4.5 adımlarını tekrarlayın. - 4.7. toplam iki yıkama için. Son yıkamanın sonunda, kalan etanolü bir P10 pipeti ile temizleyin. Boncukları ~ 2 dakika kısa bir süre kurutun.</li>
	<li>Boncuk peleti opak hale geldikten hemen sonra, tüpü manyetik raftan çıkarın ve 20 μL Düşük EDTA'lı Tris Tamponu içinde yeniden süspanse edin. Boncukların kurumasına ve çatlamasına izin vermeyin.</li>
	<li>Tüm boncukların çözelti içinde olduğundan emin olmak için pipetleme veya vorteksleme ile karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Manyetik bir rafa yerleştirin ve çözeltinin ~ 2 dakika berraklaşmasını bekleyin. Ayrıştırılmış DNA'yı, aşağı akış analizi için iyi etiketlenmiş yeni bir tüpe aktarın. Manyetik boncuk taşınmasını önlemek için &lt;20 μL ekstrakte edilmiş DNA'yı aspire edin.</li>
</ol>
5. Mikobakteriyel DNA'nın qPCR sayımı
<ol>
	<li>Mikobakteriyel DNA'yı 99 mikobakteriyel atpE'nin (Rv1305) nükleotidini hedefleyen kantitatif bir PCR kullanarak ölçmek için, 5 μL üniversal prob ana karışımı (2x), her biri 0.4 μL ileri primer (5'-AATTCCTGGTGTAGCGGTGG-3', 10 μM) ve ters primer (5'-GTTTACGGCGTGGACTACCA-3', 10 μM), 0.2 μL TaqMan probu (5'-VIC-AGGAGGAACACCGGTGGCGA-MGB-3') içeren buz üzerinde numune başına 10 μL'lik bir reaksiyon karışımı birleştirin, 10 μM), 2 μL DNA şablonu ve 2 μL nükleaz içermeyen su (Tablo 3).</li>
	<li>Reaksiyonu aşağıdaki termal döngü koşullarını kullanarak çalıştırın: 60 saniye boyunca 95 °C'de ilk denatürasyon, ardından 10 saniye boyunca 95 °C'lik 35 döngü ve 30 saniye boyunca 60 °C (burada bir yakalama ile, 2.11 °C/s'lik bir rampa hızı kullanılarak; Tablo 4). NOT: Bu durumda, qPCR, bir QuantStudio 3 Gerçek Zamanlı PCR Sisteminde VIC etiketli prob ile bir TaqMan testi kullanılarak gerçekleştirildi,</li>
	<li>Tüm örnekleri, standartları ve denetimleri teknik üçlüler halinde çalıştırın. Saflaştırılmış M. tuberculosis DNA'sının seri dilüsyonlarını kullanarak standart eğriler oluşturun. Analiz Yazılımını kullanarak bağıl niceleme analizi yapın.</li>
	<li>Elde edilen göreli niceleme değerlerini CSV formatına aktarın ve ekstraksiyon yöntemlerinde DNA verimlerini karşılaştıran kutu grafikleri oluşturmak için R Studio'yu (sürüm 2024.09.1+394) kullanarak görselleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Jouet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+amplicon+sequencing+for+culture-free+prediction+of+susceptibility+or+resistance+to+13+anti-tuberculous+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Deep amplicon sequencing for culture-free prediction of susceptibility or resistance to 13 anti-tuberculous drugs.</a> Eur Respir J. 57 (3), 2002338(2021).</li>
<li>George, S., et al. DNA Thermo-Protection Facilitates Whole Genome Sequencing of Mycobacteria Direct from Clinical Samples by the Nanopore Platform. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGeorge%2C+S+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2020).</li>
<li>Doyle, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+whole-genome+sequencing+of+sputum+accurately+identifies+drug-resistant+mycobacterium+tuberculosis+faster+than+MGIT+culture+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct whole-genome sequencing of sputum accurately identifies drug-resistant mycobacterium tuberculosis faster than MGIT culture sequencing.</a> J Clin Microbiol. 56 (8), e00666-e00718 (2018).</li>
<li>Noordhoek, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+Specificity+of+PCR+for+Detection+of+Mycobacterium+Tuberculosis%3A+A+Blind+Comparison+Study+among+Seven+Laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and Specificity of PCR for Detection of Mycobacterium Tuberculosis: A Blind Comparison Study among Seven Laboratories.</a> J Clin Microbiol. 32, (1994).</li>
<li>Jaber, M., Rattan, A., Verma, A., Tyagi, J., Kumar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+DNA+extraction+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tubercle+Lung+Dis%22%5BJournal%5D)">A simple method of DNA extraction from Mycobacterium tuberculosis.</a> Tubercle Lung Dis. 76 (6), 578-581 (1995).</li>
<li>Käser, M., Ruf, M. T., Hauser, J., Marsollier, L., Pluschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+method+for+preparation+of+DNA+from+pathogenic+and+environmental+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimized method for preparation of DNA from pathogenic and environmental mycobacteria.</a> Appl Environ Microbiol. 75 (2), 414-418 (2009).</li>
<li>De Almeida, I. N., Da Silva Carvalho, W., Rossetti, M. L., Costa, E. R. D., De Miranda, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Six+Different+DNA+Extraction+Methods+for+Detection+of+Mycobacterium+Tuberculosis+by+Means+of+PCR-IS6110%3A+Preliminary+Study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Six Different DNA Extraction Methods for Detection of Mycobacterium Tuberculosis by Means of PCR-IS6110: Preliminary Study.</a> BMC Res Notes. 6, 561(2013).</li>
<li>Pan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+four+DNA+extraction+methods+for+detecting+Mycobacterium+tuberculosis+by+real-time+PCR+and+its+clinical+application+in+pulmonary+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of four DNA extraction methods for detecting Mycobacterium tuberculosis by real-time PCR and its clinical application in pulmonary tuberculosis.</a> J Thorac Dis. 5 (3), 251-257 (2013).</li>
<li>Kelly-Cirino, C., Niles, J., Ray, B., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKelly-Cirino%2C+C+%22Maximizing+Mycobacterium+Tuberculosis+DNA+Yield+for+Molecular+Methods+with+PrepIT.MAX%22">Maximizing Mycobacterium Tuberculosis DNA Yield for Molecular Methods with PrepIT.MAX</a>. PD-WP-00045 (Issue 2/2015-11), Accessed January 27 (2020).</li>
<li>Votintseva, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Same-day+diagnostic+and+surveillance+data+for+tuberculosis+via+whole-genome+sequencing+of+direct+respiratory+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Same-day diagnostic and surveillance data for tuberculosis via whole-genome sequencing of direct respiratory samples.</a> J Clin Microbiol. 55 (5), 1285-1298 (2017).</li>
<li>Odumeru, J., Gao, A., Chen, S., Raymond, M., Mutharia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+Bead+Beater+for+Preparation+of+Mycobacterium+Paratuberculosis+Template+DNA+in+Milk%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Use of the Bead Beater for Preparation of Mycobacterium Paratuberculosis Template DNA in Milk.</a> Can J Vet Res. 65 (4), 201-205 (2001).</li>
<li>Oh, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Effective+Method+of+RNA+Extraction+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An Effective Method of RNA Extraction from Mycobacterium tuberculosis.</a> Ann Clin Microbiol. 19 (1), 20-23 (2016).</li>
<li>Miyata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+quality+of+dna+extracted+by+two+techniques+from+mycobacterium+tuberculosis+for+fast+molecular+identification+and+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of the quality of dna extracted by two techniques from mycobacterium tuberculosis for fast molecular identification and genotyping.</a> Braz J Microbiol. 42 (2), 774-777 (2011).</li>
<li>Votintseva, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+DNA+extraction+for+whole-genome+sequencing+from+early+positive+liquid+%28MGIT%29+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial DNA extraction for whole-genome sequencing from early positive liquid (MGIT) cultures.</a> J Clin Microbiol. 53 (4), 1137-1143 (2015).</li>
<li>Kolia-Diafouka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Lysis-Extraction+Method+Combined+With+IS6110-Amplification+for+Detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+Paucibacillary+Sputum+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimized Lysis-Extraction Method Combined With IS6110-Amplification for Detection of Mycobacterium tuberculosis in Paucibacillary Sputum Specimens.</a> Front Microbiol. 9, 2224(2018).</li>
<li>Bonnet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Evaluation+of+GeneLEAD+VIII+DNA+Platform+Combined+to+Deeplex+Myc-TB+Assay+to+Detect+in+8+Days+Drug+Resistance+to+13+Antituberculous+Drugs+and+Transmission+of+Mycobacterium+tuberculosis+Complex+Directly+From+Clinical+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Evaluation of GeneLEAD VIII DNA Platform Combined to Deeplex Myc-TB Assay to Detect in 8 Days Drug Resistance to 13 Antituberculous Drugs and Transmission of Mycobacterium tuberculosis Complex Directly From Clinical Samples.</a> Front Cell Infect Microbiol. 11, 707244(2021).</li>
<li>Mann, B. C., et al. Systematic review and meta-analysis of protocols and yield of direct from sputum sequencing of Mycobacterium tuberculosis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMann%2C+BC+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Schwab, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+evaluation+of+nanopore+targeted+next-generation+sequencing+to+predict+drug-resistant+tuberculosis+from+native+sputum+in+South+Africa+and+Zambia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Field evaluation of nanopore targeted next-generation sequencing to predict drug-resistant tuberculosis from native sputum in South Africa and Zambia.</a> J Clin Microbiol. 63 (3), e0139024(2025).</li>
<li>Colman, R. E., Seifert, M., De la Rossa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+culture-free+targeted+next-generation+sequencing+for+diagnosing+drug-resistant+tuberculosis%3A+a+multicentre+clinical+study+of+two+end-to-end+commercial+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluating culture-free targeted next-generation sequencing for diagnosing drug-resistant tuberculosis: a multicentre clinical study of two end-to-end commercial workflows.</a> Lancet Infect Dis. 25 (3), 325-334 (2025).</li>
<li>Oberacker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-On-Magnetic-Beads+%28BOMB%29%3A+Open+platform+for+high-throughput+nucleic+acid+extraction+and+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Bio-On-Magnetic-Beads (BOMB): Open platform for high-throughput nucleic acid extraction and manipulation.</a> PLoS Biol. 17 (1), e3000107(2019).</li>
<li>Limberis, J. D., Metcalfe, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turbolysis%3A+A+low-cost%2C+small+footprint+alternative+to+commercial+bead+beaters+for+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22HardwareX%22%5BJournal%5D)">Turbolysis: A low-cost, small footprint alternative to commercial bead beaters for cell lysis.</a> HardwareX. 19, e00576(2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.1 mm Zirkonya-Silikat Boncuklar</td><td>Biospec Ürünleri</td><td>11079101Z</td><td>Mikobakteriyel hücreleri parçalamak için boncuk çırpma adımı için kullanılan boncuklar</td></tr><tr><td>AMPure XP Boncukları</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880 Serisi</td><td>Lizis sonrası DNA temizliği için manyetik boncuklar</td></tr><tr><td>EDTA (0.5M, pH 8.0)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>AM9260G</td><td>Özel Triton/ Düşük EDTA Tampon Bileşenleri</td></tr><tr><td>Hızlı Hazırlık 24</td><td>MPbio, Amerika Birleşik Devletleri</td><td>116004500</td><td>6,5 m/s'de boncuk çırpma ekipmanı</td></tr><tr><td>İleri Astar</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>Özel sentez</td><td>Primer dizisi: AATTCCTGGTGTAGCGGTGG</td></tr><tr><td>H2O (Su, moleküler biyoloji sınıfı)</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>BP2819-1</td><td>Özel Triton/ Düşük EDTA Tampon Bileşenleri</td></tr><tr><td>Luna Üniversal Prob</td><td>New England Biyolaboratuvarları</td><td>M3004 Serisi</td><td>Mikobakteriyel DNA sayımı için qPCR reaktifi</td></tr><tr><td>MycoPrep Kiti</td><td>BD</td><td>SKU/REF 240863</td><td>NALC-NaOH Balgam İşleme için BD MycoPrep Numune Parçalama</td></tr><tr><td>NaCl (Sodyum Klorür, 5M çözeltisi)</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>AM9759 Serisi</td><td>Özel Triton/ Düşük EDTA Tampon Bileşenleri</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Millipore Sigma</td><td>P2272</td><td>Balgam İşleme</td></tr><tr><td>Ters Astar</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>Özel sentez</td><td>Primer dizisi: GTTTACGGCGTGGACTACCA</td></tr><tr><td>TaqMan Sondası</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>Özel sentez</td><td>Prob sırası: AGGAGGAACACCGGTGGCGA</td></tr><tr><td>Tris-HCl (1M, pH 8.0)</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>AM9855G</td><td>Özel Triton/ Düşük EDTA Tampon Bileşenleri</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>28314</td><td>Özel Triton/ Düşük EDTA Tampon Bileşenleri</td></tr></tbody></table>

Özel tamponda boncuk Çırpma kullanılarak mikobakteriyel dna ekstraksiyonu ve ardından ngs İş akışı

Mycobacterial DNA Extraction using Bead Beating in Custom Buffer Followed by NGS Workflow

DNA ekstraksiyon protokolünü hem kültürlenmiş M. tuberculosis hem de M. tuberculosis çivili balgam örneklerinde test ettik (her durum için n = 3). Kültürlenmiş M. tuberculosis H37Rv mc² 7901 kullanarak, girişi 50 μL'de 8.4 x10 6 hücreye standardize ettik, bu da 200 GU'da 1 mL'lik bir MGIT kültürüne eşdeğerdir. Balgam deneyleri için, tüberküloz dışı solunum rahatsızlıkları olan bireylerden (ticari olarak elde edilen) toplanan 1 mL balgamı iki farklı bakteri konsantrasyonuyla (50.000, ...

Özel Tamponda Boncuk Çırpma Kullanılarak Mikobakteriyel DNA Ekstraksiyonu ve Ardından NGS İş Akışı

Tuberculosis is a deadly disease, and the emergence of antibiotic drug resistance in the causative agent bacterium, Mycobacterium tuberculosis, worsens ...

mycobacterial-dna-extraction-using-bead-beating-custom-buffer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İki bitki organelleri DNA zenginleştirme yönteminin karşılaştırılması ve optimizasyonu sunulmaktadır: geleneksel diferansiyel santrifüjleme ve metilasyon durumuna dayalı toplam gDNA'nın fraksiyonlanması. Ortaya çıkan DNA miktarını ve kalitesini değerlendirir, kısa okunmuş yeni nesil dizilemede performans gösteririz ve uzun okunan tek moleküllü dizilemede kullanım potansiyelini tartışırız.

Yeni nesil Sıralama için Uygun Bitki Organelleri DNA Zenginleştirme Yöntemlerinin Optimizasyonu ve Karşılaştırmalı Analizi

Nanopore teknoloji sıralama biomolecules için geniş uygulamalar patojenler, gıda güvenliği izleme, genom analizi, metagenomic çevre izleme ve bakteriyel karakterizasyonu kimliği de dahil olmak üzere Yaşam Bilimleri içinde vardır. antibiyotik direnci. Bu makalede, metagenomic toprak DNA sıralama nanopore sıralama teknolojisini kullanarak tür tanımlayıcısı için yordam gösterilmiştir.

Nanopore DNA sıralama Metagenomic toprak analizleri için

Burada, toprak, rizosferde ve kök endosphere microbiomes amplicon sıra verileri elde etmek için bir protokol açıklayın. Bu bilgiler kompozisyon ve çeşitlilik bitki ilişkili mikrobiyal toplulukların araştırmak için kullanılan ve bitki türlerinin geniş bir kullanım için uygundur.

Kök Microbiome keşfetmek: toprak, rizosferde ve kök Endosphere bakteriyel topluluk verileri ayıklama

Uzun okunur dizileri büyük ölçüde karmaşık genleri ve yapısal değişim karakterizasyonu montajı kolaylaştırmak. Biz sıralama nanopore tabanlı platformlar tarafından olağanüstü uzun dizileri oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Yaklaşım kilobaz okuma orta kapsama ile yüzlerce insan hücreleri oluşturmak için değiştirilen kitaplığı hazırlıklar ardından en iyi duruma getirilmiş bir DNA ekstraksiyon benimser.

Bütün genomik DNA analizi için olağanüstü uzun okunur sıralama

Burada açıklanan serbestçe kullanılabilir araçları kullanarak 16S rRNA metagenomik sıralama ve analiz kullanarak mikrobiyom profilleme için basitleştirilmiş bir standart işletim prosedürüdür. Bu protokol mikrobiyom alanında yeni araştırmacılar yanı sıra daha yüksek bir çözünürlükte bakteriyel profilleme elde etmek için yöntemler güncellemeleri gerektiren yardımcı olacaktır.

İki adımlı PCR ve Yeni Nesil 16S rRNA Gen Sıralaması Kullanarak Mikrobiyota Analizi

Burada, sivrisineklerden yüksek kaliteli DNA ekstraksiyonları üretmek için manyetik boncuklar kullanan bir DNA ekstraksiyon protokolü açıklanmıştır. Bu ekstraksiyonlar, aşağı akış yeni nesil sıralama yaklaşımı için uygundur.

Yeni Nesil Sıralama için Manyetik Boncuk Bazlı Sivrisinek DNA Ekstraksiyon Protokolü

Gen ekspresyonu, gen promotörlerinin distal düzenleyici elementlerle etkileşimleri ile düzenlenir. Burada, düşük girişli Capture Hi-C'nin (liCHi-C) daha önce ölçülemeyen nadir hücre tiplerinde bu etkileşimlerin tanımlanmasına ne kadar izin verdiğini açıklıyoruz.

Kıt hücre popülasyonlarında promotör merkezli uzaysal-zamansal genom mimarisini incelemek için entegre bir iş akışı

Mycobacterium tuberculosis'in aşağı akış hedefli yeni nesil dizilemesi için manyetik boncuk saflaştırması ile birleştirilmiş matris tabanlı bir ekstraksiyon yöntemi kullanarak dekontamine balgamdan DNA ekstraksiyonu için optimize edilmiş bir yöntem sunuyoruz.

Dekontamine Balgam Örneklerinde Hedeflenen Yeni Nesil Dizileme için Matris Tabanlı DNA Ekstraksiyonu

Bu protokol, mikobakterilerden yüksek kaliteli DNA çıkarmak için CTAB yöntemini tanımlar; bu yöntem, onların dayanıklı, mikolik asit açısından zengin hücre duvarlarının getirdiği zorlukları aşmaktadır. Bu süreç, enzimatik sindirim, CTAB ile hücre lizisi ve organik ekstraksiyon ile etanol çökeltilemesiyle DNA arındırmasını içerir. Bu yöntem, moleküler çalışmalar için uygun DNA üretir ve mikobakteriyel araştırmalar için güvenilirdir.

Mycobacterium Türlerinden Setiltrimetilamonium Bromid Tekniği ile Tam Genom Deoksiribonüklein Asit Ekstraksiyonu

Burada, hedef zenginleştirme kullanarak klinik örneklerden bakteriyel cinsel yolla bulaşan enfeksiyonların tüm genom dizilimini sağlamak için bir protokol sunuyoruz. Bu yeni, sendromik panel tabanlı yöntem, bol miktarda insan DNA'sı ve düşük bakteri yüklerinin zorluklarının üstesinden gelerek Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum ve Mycoplasma genitalium için genomik sürveyansı kolaylaştırır.

Hedef Zenginleştirme İş Akışı Kullanarak Klinik Örneklerden Tüm Bakteri Genomları Oluşturma

Mevcut çalışma, kromozom dizisi zaten biliniyor veya ilgi çekici olmayan plazmidlerin nanopore dizileme iş akışını açıklıyor. Başlangıçta bir plazmid DNA zenginleştirme adımı, optimal plazmid dizisi derinliğini sağlar ve akış hücresi başına dizilenebilen örnek sayısını maksimize eder.

Nanopore dizileme tabanlı iş akışları kullanarak uzun okuma plazmid dizileme ve montajı

Öğrenin, Mycobacterium tuberculosis örneklerinden boncuk çırpma ve DNA yakalama boncuğu arıtma kullanarak hızlı DNA ekstraksiyonu yöntemini. Bu protokol, düşük kaynaklı ortamlarda NGS uygulamaları için güvenilir ve standartlaştırılmış bir çözüm sunar.

Özel Tamponda Boncuk Çırpma Kullanılarak Mikobakteriyel DNA Ekstraksiyonu ve Ardından NGS İş Akışı

Daha fazla video keşfet